贺兰山紫蘑抑制肝癌细胞增殖的物质基础及作用机制研究

从野生食用菌中筛选具有抗肿瘤功效的活性物质已成为当前国际天然药物研究的一个热点。贺兰山紫蘑是对生长于贺兰山青海云杉林中以紫红丝膜菌为主的数种丝膜菌的统称，是贺兰山最负盛名的珍贵食用菌，经常食用可起到防癌、抗癌的保健作用。目前关于其活性成分及生物活性研究未见报道。基于紫蘑体外抑制肝癌细胞增殖作用的前期实验结果，本项目以紫红丝膜菌为材料，利用多学科交叉的方法，采用活性追踪和化学分离分析相结合对其活性成分进行系统分离与结构鉴定；采用肝癌H22荷瘤小鼠实体瘤模型, 研究紫蘑体内抑癌作用及机制；体外检测对多种肝癌细胞增殖的抑制，从细胞和分子水平探讨活性成分抑制肝癌细胞增殖的作用及分子机制。旨在阐明紫蘑抑制肝癌细胞增殖发挥抗癌功效的物质基础，并从整体动物、细胞及分子水平阐释其作用机制，为贺兰山紫蘑潜在的开发价值和应用前景提供依据。项目的实施对民族地区特色资源的保护和开发利用具有重要的科学意义。

从野生食用菌中筛选具有抗肿瘤功效的活性物质已成为当前国际天然药物研究的一个热点。贺兰山紫蘑是对生长于贺兰山青海云杉林中以紫红丝膜菌为主的数种丝膜菌的统称。本项目以紫红丝膜菌为材料，建立肝癌H22荷瘤小鼠实体瘤模型, 通过体内抑癌及体外对肝癌细胞增殖的抑制作用，明确了紫蘑多糖是贺兰山紫蘑发挥抗肿瘤功效的主要活性物质。通过比较荷瘤小鼠肿瘤大小、抑瘤率、脾脏及胸腺指数及体内抗氧化酶系统的变化，表明紫蘑多糖主要是通过提高机体免疫力和抗氧化能力发挥抗癌功效。特别是紫蘑多糖联合化疗药物5-氟尿嘧啶不仅能增加其抑瘤率且能有效地降低西药对免疫器官的毒副作用，能更好地刺激脾脏淋巴细胞增殖，提高机体免疫力，且其抗肿瘤可能与提高CD4+/CD8+比值有关。小鼠血清中TNF-α、IL-2、INF-γ 3种因子含量的升高，说明紫蘑多糖能通过提高免疫因子的含量而增强宿主免疫力；三种抗氧化酶（T-SOD、CAT和GSH-Px）活力的升高和MDA含量的降低，说明紫蘑多糖能提高荷瘤小鼠的抗氧化能力进而达到抗肿瘤作用。紫蘑多糖能抑制体外肝癌细胞HepG2的增殖并能诱导细胞凋亡；进一步通过体外培养小鼠腹腔巨噬细胞系RAW264.7，探讨了紫蘑多糖的免疫调节抗癌机制。结果表明紫蘑多糖可激活巨噬细胞的活性, 增强其吞噬中性红的能力，上调巨噬细胞分泌的相关免疫因子的表达水平；紫蘑多糖刺激的巨噬细胞上清液可抑制HepG-2细胞增殖，TLR2/TLR-4/CR3抗体阻断实验表明TLR2受体是介导紫蘑多糖发挥免疫调节功能的重要作用位点。以抗氧化活性为指标，筛选确定了用于紫蘑粗多糖脱色脱蛋白的大孔树脂法，并从九种大孔树脂中确定了MR-4。继而利用离子交换柱层析、凝胶柱层析等对脱色多糖进行分离纯化，MTT法跟踪检测表明活性多糖为CPⅠ，对其三个活性组分CPⅠ-1、CPⅠ-2和CPⅠ-3的一级结构进行了初步解析。其中CPⅠ-2为最主要的活性成分，重均分子量为88222Da、 单糖组成为甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、岩藻糖，摩尔比为4.2:1.3:1.0:123.5:119.3:17.04:16.3；FT-IR和1H-NMR 表明糖苷键为α糖苷构型。研究结果为揭示贺兰山紫蘑具有抗癌功效提供了科学依据，为紫蘑多糖用于化疗药物的辅助抗癌剂提供了基础数据。