CRAC介导母体T细胞功能失衡与胎儿HBV宫内感染的关联及机制研究

Intrauterine infection is an important way of mother-to-child transmission with HBV. The decline of virus cleaning ability , which is caused by low maternal T cells function,is the immunology foundation of intrauterine infection.However ,the key molecular mechanism of regulating T cells immune response function needs to be further expounded. The team found the phenomenon that T cells calcium (ca2+) influx is weaker in infection group. Combining with literature review and previous research，We supposed: HBV influences the activity of interaction molecular1 (STIM1) and induces low immune function of maternal T cells through affecting the genes and protein expression of CRAC, which makes the ability of immune protection of placenta barrier weakened and increases the risk of intrauterine infection in fetus.This project,which is based on the previous work, is to explore the changes of CRAC-STIM1 pathways, through the methods of nested case-control study and by the ways of flow cytometry(FCM), scanning confocal laser, fluorescence real-time quantitative RT-PCR, the Western-blot and gene sequence analysis technology;at the same time,it also study its influence to T cell proliferation, virus cleaned rate and immune function through the shRNA techology by upregulating and dampening the pathway, to illustrate the function and mechanism of CRAC in intrauterine infection and provide new evidence to prevent HBV intrauterine infection of neonatus.

宫内感染是HBV母婴传播的重要途径，母体T细胞免疫功能低下是其发生、发展的免疫学基础，但调节母体T细胞免疫功能的关键分子机制有待进一步阐明。课题组前期发现宫内感染组母体T细胞钙离子内流减弱，而调节T细胞增殖、活化并发挥免疫功能的关键因素是细胞膜上钙离子通道能否被有效激活。据此我们推测："HBV主要通过影响钙释放激活钙离子通道（CRAC）基因与蛋白表达，进而影响关键分子即基质相互作用分子1 (STIM1)的功能，诱发母体T细胞免疫功能低下，使胎盘屏障免疫保护能力削弱，增加胎儿宫内感染的风险"。本项目拟采用巢式病例对照研究方法，运用流式细胞术、荧光实时定量PCR、Western-blot及基因序列分析等技术研究CRAC-STIM1通路的改变情况；并通过shRNA干扰等技术调节该通路，研究其对T细胞免疫功能的影响，阐明CRAC在宫内感染发生中的作用及机制，为新生儿HBV宫内感染的防治提供新依据。

HBV母婴传播是人群中大量的乙肝病毒慢性携带者形成的重要原因。 新生儿宫内感染HBV者中约90%会发展成慢性HBV携带者，并逐渐演变为慢性乙肝、肝功能失代偿、肝硬化和肝癌，最终约25%的人会死于慢性肝病。因此，阻断母婴垂直传播、预防新生儿HBV宫内感染对降低相关肝病的发生及社会和家庭的负担有着重要意义，但有关其发生、发展的关键分子机制有待阐明。. 研目前普遍认为，母体细胞免疫应答的特性是胎儿发生HBV宫内感染的重要影响因素之一。T细胞在特异性和非特异性免疫应答中均起关键作用，其不仅负责细胞免疫，对B细胞参与的体液免疫也起辅助和调节作用。母亲T细胞克隆增殖、分泌活性的频率、强度和范围与宫内感染发生与否密切相关。然而，有关影响和调节母体T细胞增殖、分泌及杀伤功能的关键分子机制尚不清楚。. 近年来的研究发现，钙离子通道对T细胞的免疫功能调节具有重要的作用。其中，钙释放激活钙离子通道(Calcium release-activated Ca2+ channels，CRAC)是一类与人类T细胞活化关系最为密切的离子通道，其主要受T细胞受体(TCR)-抗原复合物途径发挥作用。免疫细胞内游离Ca2＋浓度的变化是Ca2＋经过钙通道跨膜转运和细胞内钙池摄取、释放等过程动态平衡的结果。通过细胞内游离Ca2＋浓度的改变达到调节免疫细胞生理功能，也是多种受体激动后信号传递过程中的中心环节。Ca2＋作为淋巴细胞激活的第二信使，在细胞的免疫功能调控中起着关键的作用。基质相互作用分子1(Stromal interaction molecule l, STIM1)可能是影响CRAC作用的关键因素之一。而CRAC-STIM1途径异常与多种感染性疾病相关，但在宫内感染发生中的作用不明。. 综上，本项目在前期人群研究的基础上，通过系统评价和人群研究，开展针对上述通道与HBV宫内感染的发生、发展的危险因素及机制研究。通过开展人群研究和体外实验，运用流式细胞术扫描激光共聚焦检测、荧光实时定量RT-PCR检测、Western-blot实验及shRNA干扰等技术，研究CRAC与HBV宫内感染发生的关系。研究结果表明：1.HBV DNA和HBeAg是宫内感染的独立危险因素；2. HBV可能通过影响钙释放激活钙离子通道（CRAC）基因与蛋白的表达，改变CRAC的表达，诱发母体T细胞的免