基于TLR-4/NF-κB信号通路探讨解毒化瘀扶正法治疗内毒素性肺损伤的作用机制

Acute lung injury is one of uncontrolled inflammatory syndrome after severe trauma or infection, and the TLR4/NF-κB signal passage is most closely related to the immune and inflammatory response. The therapy of detoxifying and clearing stasis with righting is more suitable to the considerations on Chinese Medical Syndrome Differentiation of acute lung injury, and can regulate inflammatory response effectively. This topic develops the Modified Qingying Granule (Qingying decoction together with american ginseng and rhubarb), and observes the effects on the inflammatory factor in the plasma and the the expression of NF-κB、TLR4mRNA、 AQP-1、NF-κB and TLR4 protein in the lung tissue of the rat model of endotoxin induced lung injury; researches on the expression and role of TLR4/NF-κB signal pathway in LPS-induced rat lung injury by RNA interference technique, and through further in vitro experiment that observes the effects of drug-containing serum on LPS-induced rat alveolar macrophage cell line NR8383 inflammatory cytokine secretion and the effects on the expressions of TLR4、NF-κB subunit P65 mRNA and protein, to reveal the effects of the therapy of detoxifying and clearing stasis with righting on TLR-4/NF-κB signal passage of endotoxin induced lung injury. This topic leads the research work about the function and mechanism of the Modified Qingying Granule on endotoxin induced lung injury from various aspects and levels, and lays the foundation of clinical development of new drugs.

急性肺损伤是严重创伤或感染出现的一种失控性炎症反应综合症，TLR4/NF-κB是与机体免疫及炎症反应最为密切的信号通路。解毒化瘀扶正法符合急性肺损伤的中医辨证思路，可有效调控炎症反应。本课题研制加味清营颗粒（清营汤加西洋参、大黄），观察对内毒素性肺损伤大鼠模型血浆中炎症因子及肺组织NF-κB、TLR4mRNA、AQP-1、NF-κB 及TLR4蛋白的影响；运用RNA干扰技术，研究TLR4/NF-κB信号通路在LPS诱导的大鼠肺损伤中的表达与作用，并进一步通过含药血清对大鼠肺泡巨噬细胞系NR8383炎症因子分泌的影响及TLR4和NF-κB 亚基P65 mRNA及蛋白表达影响的实验，揭示解毒化瘀扶正法对内毒素性肺损伤TLR-4/NF-κB信号转导通路的影响。本课题率先研究从多方面、多层次来探讨加味清营颗粒对内毒素性肺损伤的作用及机制，为临床开发新药打下基础。

急性肺损伤是严重创伤或感染出现的一种失控性炎症反应综合症，TLR4/NF-κB是与机体免疫及炎症反应最为密切的信号通路。解毒化瘀扶正法符合急性肺损伤的中医辨证思路，可有效调控炎症反应。本项目以加味清营汤颗粒（清营汤+西洋参、大黄）作为载体，针对内毒素性肺损伤“毒入营血分”的病理状态，选取TLR-4/NF-κB信号通路为切入点，通过整体动物实验和体外细胞培养、血清药理学实验及构建TLR4基因RNAi慢病毒表达载体，研究解毒化瘀扶正法中药调控TLR-4/NF-κB信号通路治疗内毒素性肺损伤的作用机制。整体动物实验研究结果显示：1、加味清营颗粒可有效降低大鼠急性肺损伤时炎性因子IL-1β、TNF-α的表达，提高抗炎因子IL-10的表达，也可降低支气管肺泡灌洗液中蛋白的含量，从而减轻肺部炎症细胞浸润，对损伤的肺组织起到修复保护的作用。2、造模后大鼠组织细胞中TLR4和NF-kB p65的表达量增强，加之下游炎性因子IL-1β、TNF-α均有升高，表明TLR-4/NF-κB信号通路参与了ALI的发生、发展过程。而加味清营颗粒能有效降低急性肺损伤大鼠肺组织TLR4和NF-kB p65 的阳性表达，从而减轻了后续的炎症反应。3、加味清营颗粒能有效提高急性肺损伤大鼠肺组织AQP-1的阳性表达，纠正水转运紊乱，减轻了肺水肿，从而起到肺组织保护作用。构建TLR4基因RNAi慢病毒表达载体：本研究成功构建了TLR4基因RNAi慢病毒表达载体，TLR4基因敲减效率达到90.1%，表明本研究构建的慢病毒RNAi表达载体在NR8383细胞内能有效地沉默TLR4基因表达，为后续研究TLR4信号通路在急性肺损伤发病过程的的作用及中药干预的靶点奠定了基础。体外细胞培养研究结果显示：1、加味清营颗粒可以显著降低体外培养大鼠肺泡巨噬细胞系NR8383在LPS刺激后细胞培养上清液中炎症因子TNF-α、IL-10的含量。2、 LPS刺激后的大鼠肺泡巨噬细胞系NR8383 TLR4、NF-κB的mRNA和蛋白表达有所升高，而加味清营颗粒含药血清可以降低二者的表达，从而减轻了下游的炎症反应。