肝细胞癌骨转移：稳定的小鼠肿瘤模型系统的建立及分子机制研究

Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the commonest malignant tumours. An increasingly high occurrence of bone metastases in HCC patients highlights the importance of fundamental research on HCC bone metastasis, which have been in poor situation for long due to lack of suitable model system. In this research program, we are supposed to solve the following problems: 1. Establishment of experimental and spontaneous animal model of HCC bone metastasis by intracardiac injection or tumour xenograft orthotopic transplantation respectively. 2. Establishment of HCC cell lines with unique potential to form bone metastasis (BM cells) by means of successive "liver to bone"or"heart to bone"in vivo selection (more than 3 passages). 3. mRNA-based expression microarray and miRNA microarray to analyze differences between BM cells and parental cells, finding candidates for HCC bone metastasis-related genes and miRNAs. 4. Collection of patients' tissue samples of primary HCC and bone metastasis, corroboration of HCC bone metastasis-related genes and miRNAs in tissue samples. 5. Comprehensive oncological in vitro/in vivo assays to explore the mechanisms of HCC bone metastasis-related genes and miRNAs, and to elucidate its potential value in clinic.

肝细胞癌是最常见的恶性肿瘤之一，进展期骨转移多见且呈逐年上升趋势，给病人造成严重痛苦。由于缺乏模拟人肝细胞癌骨转移过程的模型系统，基于模型的肝癌骨转移分子机制研究未见报道。本研究拟解决以下问题：一.利用肝癌细胞系或临床肝癌标本，行肝脏原位种植或左心室注射，建立自发性或实验性肝癌骨转移动物模型。二.行"肝－骨"及"左心室－骨"连续体内筛选三代以上，获得具有特异性骨转移潜能的肝癌细胞系，并分析其与亲代细胞在增殖、侵袭、成瘤等表型差异。三.利用具有特异性骨转移潜能的肝癌细胞系，与其亲代细胞系行基因表达谱芯片及miRNA芯片检测并分析差异，寻找与肝癌骨转移相关的候选基因及miRNA。四.临床收集人肝癌及骨转移癌标本，验证上述候选基因/miRNA的表达,确定肝癌骨转移相关基因及miRNA。五.开展体内/外实验，探索肝癌骨转移相关基因及miRNA的作用机制，为肝癌骨转移的治疗提供新的思路和理论依据。

本项目旨在建立有效可靠的肝细胞癌骨转移研究动物模型及初步探究此种转移的分子机制。如期完成本项目研究，研究结果主要包括以下四个方面的内容：.1.高度骨转移潜能肝细胞癌细胞系BM1的成功构建。将人肝癌细胞系HCC LM3从裸鼠左心室注射以建立肝细胞癌骨转移模型。从骨转移灶中分离出发生骨转移的肝癌细胞并进行体外扩增培养，成功建立肝细胞癌骨转移细胞系BM1。体内实验证实BM1比其亲代细胞系HCC LM3发生骨转移时间更早，特异性更高，具有更强的诱导骨破坏形成的能力。体外实验证明BM1比HCC LM3具有更强的运动侵袭能力以及克隆形成能力。.2.建立了第四代骨转移细胞系BM4。通过"左心室－骨"连续体内筛选四代，获得了骨转移能力更强的，特异性更高的肝细胞癌骨转移细胞系BM4。.3.利用基因表达谱芯片寻找肝细胞癌骨转移相关基因。提取HCC LM3，BM1， BM2， BM3， BM4细胞总RNA行基因芯片分析寻找差异表达基因。发现了肝细胞癌骨转移相关基因GRAMD4，并初步验证了其对肝细胞癌骨转移的抑制作用。.4.发现了肝癌细胞系中LncRNA（长链非编码RNA）H19的表达对于肝细胞癌骨转移的作用，并初步探究了其发挥作用的分子机制。.本项目成功建立了肝细胞癌骨转移稳定的小鼠肿瘤模型及细胞系，初步探究了相关分子机制。为深入研究肝细胞癌骨转移提供了可靠的动物模型和机制基础。