PPR蛋白OsPPR920参与调控水稻花粉发育的分子机制研究

Rice is one of most important crops in the world, and male reproductive development and pollen fertility decision is a critical stage in its life cycle. Understanding the mechanism governing this process is both a fundamental question in plant biology and also an important task in agriculture application. In this study, we will focus on a rice male reproductive development related gene,OsPPR920, analyze its expression in different tissues and at different rice development stages, and create OsPPR920 RNAi transgenic lines and mutants for phenotype observation, to analyze the functions of OsPPR920 protein and its PPR motifs. Furthermore, OsPPR920 protein function in mitochondria will be investigated deeply, to reveal which mitochondrial RNA transcript and what biological process OsPPR920 protein involves in. Last, We will confirm the interaction between OsPPR920 and Osj10gBTF3 protein, and co-analyze the relationship between OsPPR920 and other genes in Osj10gBTF3 regulation pathway. These results will provide us preliminary cues for roles of OsPPR920 in Osj10gBTF3 regulation pathway. In short, this study will reveal the molecular mechanism of PPR protein OsPPR920 involved in rice male reproductive development process, to further understand the regulation mechanism of CMS/Rf system in plants.

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，而花发育及花粉育性的决定是其生命周期中的关键发育阶段。理解调控这一重要农艺性状的机理，既是植物生物学的重要基础研究课题，也是农业生产应用上的重要任务。本研究围绕一个参与调控水稻花粉发育的OsPPR920基因,分析其时空表达模式，获得OsPPR920 RNAi转基因株系及突变体材料进行表型分析，进行初步基因功能鉴定；深入解析OsPPR920蛋白在线粒体中的功能，明确其参与线粒体中哪一RNA分子转录后的何种生物学过程，从分子机理上揭示该蛋白对花粉发育的调控作用；通过验证OsPPR920与Osj10gBTF3蛋白的互作，并与调控途径中其它基因进行关联分析，初步探索 OsPPR920在Osj10gBTF3调控途径中的作用。本研究将阐明PPR蛋白OsPPR920参与调控水稻花粉发育的分子机制，进一步理解植物调控细胞质雄性不育及育性恢复的CMS/Rf系统的作用机理。

在高等植物体内，PPR蛋白是一类由核基因编码，可以与RNA结合的蛋白家族。一些PPR蛋白可以作为剪接因子参与线粒体group II 内含子的剪接，从而在转录后水平上调控线粒体基因的表达。水稻的基因功能研究表明，PPR蛋白不仅可以在水稻线粒体中发挥内含子剪接的功能，它们还可以作为育性恢复因子（restorer-of-fertility，Rf）修复线粒体基因的异常表达，从而使雄性不育的性状恢复到正常可育。. 本实验室在前期研究水稻Osj10gBTF3基因时通过酵母双杂交实验发现了一个可能与Osj10gBTF3蛋白互作的蛋白。生物信息学分析表明该蛋白是由939个氨基酸组成的典型PPR蛋白，我们将其命名为OsPPR939，它是与已报到的育性恢复因子Rf1a，Rf1b及RF5等类似的RF-like蛋白。目前，水稻PPR蛋白的相关研究报道较少，其作用机制有待进一步解析，同时鉴于花粉育性对农作物产量这一重要农艺性状的决定性作用，我们对OsPPR939进行功能研究。. 首先通过在水稻原生质体和转基因拟南芥中做亚细胞定位，发现该蛋白定位于线粒体。我们将利用荧光定量 PCR 分析了 OsPPR939 基因在水稻不同组织，以及花发育的七个不同时期的表达情况，发现该基因在所有检测部位组成型表达，且在愈伤，花药，早期小花中的表达量最高。为了研究该基因在分子水平上的功能，我们用CRISPR/Cas9基因打靶技术创造了osppr939突变体。对两个不同突变位点的纯合突变体进行表型分析发现，相较于野生型，突变体植株矮小，花粉部分败育，但花的形态没有明显改变。另外，结实率也有明显降低。说明该基因在水稻植株生长和花粉发育上发挥重要作用。根据OsPPR939线粒体定位，我们利用RT-PCT和qRT-PCR对线粒体编码的转录本的丰度和内含子的剪接效率进行检测，发现该蛋白参与线粒体nad5内含子的剪接。nad5是线粒体电子传递链comple I的一个重要亚基，通过BN-PAGE实验发现突变体complex I的组装以及活性明显降低，qRT-PCT实验表明则突变体中交替氧化途径中一些基因的表达上调。上述所有实验结果可知：OsPPR939定位于水稻线粒体并参与nad5内含子1，2，3的剪接，通过维持nad5的正常表达保证complex I的活性和电子传递，从而参与植株生长和花粉