SOD、CAT基因中耐氨氮相关SNP位点的确定及其耐氨氮机理的研究

Ammonia stress could inhibit the immune defenses of Lifopenaeus vannamei, and increase the susceptibility to the pathogen. Studies shown that the destruction of the antioxidant enzyme system and the accumulation of reactive oxygen species were the foremost causes of the toxicological damage by ammonia. The key genes of the antioxidant enzymes, SOD and CAT, play a very important role in the process of antioxidant and immune response. Consequently, in the present study, technologies of gene chip, real-time PCR and western blot were used to detect the temporal expression of SOD and CAT, under the conditions of breeding with high-density and chronic stress with ammonia in Litopenaeus vannamei, to reveal the action mechanism of SOD and CAT and their coordination mechanism. The approaches of selective genotyping, DNA pool, and SNP chip were utilized in the wild populations with high genetic diversity to determine the associated SNP loci from SOD and CAT, and the associated loci were confirmed by the method of cross-validation. In addition, site-directed mutagenesis at the associated SNP site was performed to detect their effects on the protein activity, revealing their mechanism and confirming the SNP loci at the protein level. This study has great significance in cultivating ammonia-resistant seeds for prevention of diseases in Litopenaeus vannamei.

氨氮胁迫可抑制对虾的免疫防御功能，增加机体对病原菌的敏感性。研究表明抗氧化酶系统的破坏及活性氧的积累是氨氮造成毒理损伤的最主要原因，而抗氧化酶系统的关键基因SOD和CAT在抗氧化过程和免疫应答中发挥着非常重要的作用。本课题通过基因芯片和real-time PCR技术、Western blot技术分别检测凡纳滨对虾SOD和CAT基因在高密度养殖、氨氮慢性胁迫条件下mRNA和蛋白水平的表达时序性，揭示其作用机理和协调作用机制；在遗传变异丰富的纳滨对虾野生群体中，利用选择性基因型法、DNA pool、SNP芯片技术从SOD和CAT基因中筛选与耐氨氮相关联的SNP标记，并利用交叉验证法在独立的野生群体中进行验证；采取基因定点突变法检测相关SNP位点对蛋白质活性的影响，揭示其作用机理，同时对相关SNP位点在蛋白水平上进行验证。此研究将对培育凡纳滨对虾耐氨氮良种预防疾病的发生具有十分重要的意义。

凡纳滨对虾是世界范围内水产养殖中举足轻重的品种，在普遍的高密度养殖活动及养殖环境不同恶化的情况下，逆境胁迫是影响其养成率的主要因素之一，其中高浓度氨氮胁迫是最普遍毒性最大的毒理因子，研究表明氨氮胁迫与对虾养殖中的高死亡率现象有着非常密切的关系。因此，为了揭示氨氮胁迫对凡纳滨毒害作用的分子机制，明确其与疾病发生之间的关系，并筛选与对虾氨氮耐受性相关的SNP标记，开展了本项目的研究。首先，利用来自94个家系的3688尾幼虾（平均体重0.55g）进行高浓度氨氮胁迫，采用REML和BLUP法对其氨氮耐受性进行了遗传力估计，结果显示无论在个体水平还是家系水平，存活时间的标准差和变异系数均比较大，表明凡纳滨对虾在氨氮耐受性方面具有较大的遗传变异；而且凡纳滨对虾幼虾的氨氮耐受性具有较高的遗传力，表明其可通过选育获得较快的遗传改良。其次，利用遗传背景一致的凡纳滨对虾家系，分析了其在高浓度氨氮胁迫条件下，抗氧化酶系统中的关键基因SOD、CAT和gpx的表达时序性，而且进行了比较转录组分析，从分子水平系统地分析了氨氮胁迫对凡纳滨对虾毒害的分子机理，为选育具有高耐受性的凡纳滨对虾新品种提供了有力的理论依据。接着，从比较转录组分析获得的应答氨氮胁迫的关键基因中选取了20候选SNP位点，利用Sequenom MassARRAY技术对其在氨氮耐受性群体和氨氮敏感群体进行了分型检测，经关联分析获得了4个与氨氮耐受性显著相关的SNP标记，来培育出耐受氨氮环境的优良凡纳滨对虾苗种提供了重要的工具。最后，以氨氮耐受群体和氨氮敏感群体为实验材料进行了WSSV敏感性差异的分析，首次探索了通过提高对虾对逆境急性胁迫应激的耐受性而间接提高其对病原的抵抗力的可能性，结果表明氨氮胁迫会增加对虾对病原的敏感性，而且对氨氮胁迫耐受力高的群体对病毒的抵抗力也高，为探索提高对虾抗病性而降低养殖中的死亡率提供了新的思路和途径。本项目共发表SCI 6篇，中文核心1篇，授权专利5项，软件著作权1项，超额完成合同中的全部考核指标。