血浆食管癌外来体穿梭microRNAs在细胞间通讯中的机制研究及其在高危人群筛检中的诊断价值

血浆miRNA具有肿瘤特异性和高度稳定性，提示其可能成为一种新的肿瘤标志物。现有研究显示血浆miRNA可能来源于肿瘤细胞分泌的外来体，且与肿瘤细胞中的miRNA表达特征不同，提示外来体中的miRNA可能有其独特的生物学功能。本研究拟通过分析miRNA在血浆食管癌外来体的表达特征，明确候选miRNA是否参与食管癌细胞间通讯作用，阐明其对受体细胞靶基因的调控机制，识别相关信号转导通路和调控作用网络，探讨外来体穿梭miRNA的肿瘤细胞间通讯作用机制，从而阐明血浆食管癌外来体穿梭miRNA在食管癌细胞间通讯中的生物学功能及其在食管癌发生发展中的作用。通过多肿瘤人群研究构建敏感、特异的血浆食管癌穿梭miRNA指标体系，并通过高危人群的筛检试验，评价该体系的诊断价值，以期为食管癌高危人群的早发现和早诊断提供有效的技术指标，并为食管癌的靶向基因治疗提供有应用前景的传递载体策略及潜在作用靶点。

血浆microRNA（miRNA）具有肿瘤特异性和高度稳定性，提示其可能成为一种新的肿瘤标志物。现有研究显示血浆miRNA可能来源于肿瘤细胞分泌的外来体，且与肿瘤细胞中的miRNA表达特征不同，提示外来体中的miRNA可能有其独特的生物学功能。本项目在我国食管癌高发区之一江苏省淮安地区招募食管癌新发病例和健康对照，采集食管癌患者术前血浆和健康对照的血浆等生物样本，利用miRNA芯片筛选了3对食管癌患者和健康对照血浆中差异表达的miRNA，并应用人群流行病学研究对初筛的食管癌患者和健康对照血浆中差异表达miRNA的水平进行验证，单因素条件logistic回归分析结果显示食管癌患者血浆miR-21表达上调和miR-155表达下调可增加食管癌的发病风险，是食管癌的候选生物标志。研究进一步利用Solexa高通量测序技术鉴定食管癌细胞及其分泌外来体中miRNA的表达谱，筛选血浆中候选肿瘤特异miRNA。由于外来体对miRNA的摄取是一个主动选择的过程，结合外来体miRNA Solexa高通量测序结果，本研究选择在食管癌患者血浆中表达上调且在外来体中表达水平较高的miR-21作为研究对象。项目进一步应用UltraVIEW Vox活细胞激光共聚焦显微术和荧光标记miR-21 mimics追踪了食管癌细胞外来体穿梭miR-21在细胞间的传递过程。为探讨外来体穿梭miR-21在食管癌细胞间通讯中的作用，项目通过构建稳定的供体细胞（食管癌细胞EC9706）-受体细胞（食管癌细胞EC9706和人脐静脉血管内皮细胞HUVECs）共培养模型，探讨了外来体穿梭miR-21参与的生物学功能及其调控的相关通路；并结合细胞生物学研究，发现外来体穿梭miR-21发挥癌基因样功能参与了细胞迁移、侵袭、血管生成相关通路的调控。进一步应用3’UTR双荧光素酶报告基因分析证实外来体穿梭miR-21可通过调控转移相关基因PDCD4的表达参与食管癌的转移机制。通过加入LY294002（PI3K/Akt抑制剂）和L-NAME（eNOS抑制剂）验证了外来体穿梭miR-21通过PTEN/Akt/eNOS/NO途径促进了食管癌肿瘤微环境中血管内皮细胞的血管生成，从而为食管癌组织的生长提供血供。研究结果提示外来体穿梭miR-21可作为食管癌特异血浆生物标志用于高危人群的早发现和早诊断，并可作为食管癌基因治疗的潜在作用靶点。