基于内质网应激探讨PPAR-γ激活对糖尿病缺血再灌注肾脏保护的分子机制

Endoplasmic reticulum stress (ERS) is a protective mechanism of cells, ERS have double-edged effect, which can promote survival and apoptosis signal. Reactive oxygen species (ROS) may trigger ERS. Studies on gastric ischemia-reperfusion injury (IRI) and breast cancer have identified peroxisome proliferators-activated receptor gamma (PPAR-γ) was associated with ERS. Our previous studies have shown that pioglitazone can activate PPAR-γ and protect renal IRI by antioxidant stress in mice. Further preliminary experiments show that pioglitazone can also protect renal IRI of diabetic rat. The scientific hypothesis that "pioglitazone may activate PPAR-γ and protect renal IRI through regulating ERS in diabetic rats" is put forward on the basis of our previous study. To verify the hypothesis, we will cuture renal tubular epithelial cell line of rat under hyperglycemic stimulation and establish renal IRI model of diabetes rat. Using the methods of real time PCR, Western blot, etc, from the overall level of the molecules, cells, tissues and animals aspects, we will discuss the mechanism that pioglitazone activates PPAR-γ and protect the renal IRI in diabetic rats by regulating ERS signals and clarify the correlation of PPAR-γ activation and ERS or ROS at different stages of renal IRI in diabetic rats.

内质网应激（ERS）是细胞的一种自我保护机制，ERS具有双刃剑作用，能诱导促生存和促凋亡信号，氧自由基（ROS）可以触发ERS。胃缺血再灌注损伤（IRI）和乳腺癌等研究已证实过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)激活与ERS具有相关性。我们前期研究表明吡格列酮激活PPAR-γ可以通过抗氧化应激保护小鼠肾IRI。进一步预实验表明吡格列酮还可以保护糖尿病大鼠肾IRI。本研究在前期基础上提出科学假说即“吡格列酮激活PPAR-γ可能通过调控ERS对糖尿病肾IRI起保护作用”，为了验证此假说，将通过高糖刺激的大鼠肾小管上皮细胞系和糖尿病大鼠肾IRI模型，采用real time PCR、Western blot等手段，从分子、细胞、组织以及动物整体水平等多方面探讨ERS信号在吡格列酮激活PPAR-γ保护糖尿病肾IRI中的作用，明确糖尿病肾IRI不同阶段PPAR-γ激活与ERS和ROS的相关性。

本研究通过建立糖尿病大鼠肾缺血再灌注损伤模型，应用PCR、免疫印迹等方法检测了盐酸吡格列酮预处理糖尿病大鼠肾IRI后24h肾组织中内质网应激相关蛋白ATF4、GRP78等的表达以及凋亡蛋白bcl-2、bax、caspase-3、caspase-8的表达；同时通过体外高糖环境下培养肾小管上皮细胞NRK-52E缺氧4h/复氧12h模型，同样检测了细胞上述内质网相关蛋白和抗氧化应激酶的表达以及细胞凋亡情况。主要研究结果：1.盐酸吡格列酮可以降低糖尿病大鼠肾IRI后血清肌酐和尿素氮水平；减少肾组织中细胞的坏死与凋亡；2.盐酸吡格列酮升高糖尿病大鼠肾IRI后肾组织中bcl-2蛋白表达，降低bax蛋白表达，同时也降低caspase-3和caspase-8蛋白剪切片段表达；3.盐酸吡格列酮降低糖尿病大鼠肾组织中内质网相关蛋白ATF4、GRP78表达；4.经盐酸吡格列酮预处理的高糖环境培养的肾小管上皮细胞NRK-52E缺氧4h/复氧12h，可以降低内质网相关蛋白ATF4、GRP78表达，以及减少细胞凋亡；5.经盐酸吡格列酮预处理的高糖环境培养的肾小管上皮细胞NRK-52E缺氧4h/复氧12h，可以升高SOD、CAT和GSH水平，降低MDA水平。上述结果表明，盐酸吡格列酮激活PPAR-γ对糖尿病肾缺血再灌注损伤后肾小管上皮细胞内质网应激可以起到调控作用。本研究进一步从内质网应激角度阐明PPAR-γ激活保护糖尿病肾缺血再灌注损伤的分子机制，初步探寻了防治糖尿病肾缺血再灌注损伤的新靶点。