南方根结线虫乙酰胆碱酯酶基因克隆及其与噻唑膦抗药性的关系分析

Meloidogyne incognita is the main nematode distributed in northern China, which may cause serious yield loss of vegetabls. Treatment with chemical pesticides is the most effective measure to control root-knot nematodes. However, M. incognita in some district of Beijing already devoloped resistance to the fosthiazate pesticide. Acetylcholinesterase (AChE) is the target of organophosphate nematicides.Different AChE genes have differences in the molecular weight,substrate affinity, sensitivity of detergents and inhibitors.Based on the clone of AChE genes, the differences of gene sequences between resistant and sensitive population of M. incognita, the effect of gene mutation of AChE on the resistance of nematicides will be analyzed. RNA interference will be used to silence the function of AChE genes and compare the activity of AChE, the sensivity of fosthiazate and substrate before or after gene silencing.Results will be useful to discover the molecular mechanism of the resistance of organophosphate nematicides of M. incognita, formulate effective control stratages and ensure the safety of agricultural production.

南方根结线虫是危害北方蔬菜的主要线虫，可以引起严重的产量损失。使用化学杀线虫剂是防治根结线虫最有效的措施，但由于长期单一使用或超剂量使用杀线虫剂，北京地区的南方根结线虫已对噻唑膦产生抗药性。乙酰胆碱酯酶是噻唑膦等有机磷类杀虫剂的作用靶标，不同分子型的乙酰胆碱酯酶基因在分子量大小、对底物的亲和性、对抑制剂的敏感性等方面存在较大差异。本研究通过克隆南方根结线虫乙酰胆碱酯酶基因序列，比较抗性种群和敏感种群在基因序列方面存在的差异，分析基因突变在根结线虫对噻唑膦产生抗药性中的影响；运用RNA干涉技术对乙酰胆碱酯酶基因进行沉默，比较基因沉默前后乙酰胆碱酯酶的活力、对乙酰胆碱酯酶抑制剂的反应及对噻唑膦的抗药性等方面存在的差异，从而揭示南方根结线虫对有机磷类杀线虫剂产生抗药性的机理，将对制定相应的防治策略、有效控制蔬菜根结线虫、保障农业生产安全具有重要作用。

1、.项目的背景.由于长期大量使用噻唑膦等有机磷类杀线虫剂，一些地区的南方根结线虫已对噻唑膦产生抗药性。本研究将揭示南方根结线虫对噻唑膦产生抗药性的机理，为线虫对其它药剂的抗性机制研究提供指导。.2、主要研究内容.（1）南方根结线虫抗性种群和敏感种群乙酰胆碱酯酶基因的克隆及序列分析.（2）利用RNA干涉技术沉默南方根结线虫乙酰胆碱酯酶基因的功能.（3） RNA干涉处理对南方根结线虫乙酰胆碱酯酶表达量及功能的影响.（4） 乙酰胆碱酯酶基因沉默对南方根结线虫抗药性的影响.3、重要结果及数据.（1）研究了南方根结线虫抗性和敏感种群对噻唑膦的敏感性，发现抗性种群抗性倍数是敏感种群的2.1-2.7倍，说明南方根结线虫由于噻唑膦的连续滥用确实在一定程度上对其产生了抗药性。.（2）比较了南方根结线虫抗性和敏感种群在RNA干扰前后的AChE比活力，发现南方根结线虫抗性种群AChE比活力高于敏感种群，且差异显著。.（3）比较了南方根结线虫抗性和敏感种群总AChE对噻唑膦的敏感性.噻唑膦对南方根结线虫AChE活性具有抑制作用，对噻唑膦产生抗药性的原因主要是由于AChE对噻唑膦敏感性的降低。.（4）克隆和测定了抗性种群和敏感种群乙酰胆碱酯酶基因ace1和ace2的序列并进行了序列分析，在抗性种群中发现了基因突变，其中核苷酸序列比对有68处不同，蛋白序列比对有18处不同。.（5）通过基因沉默，对南方根结线虫抗性种群进行了RNA干扰和qRT-PCR分析，采用浸泡法对南方根结抗性种群进行RNA干扰，沉默效率为48.1%，定量分析表明抗性种群中ace2基因的表达量显著增加。.（6）测定了RNA干扰后南方根结线虫抗性种群总AChE的表达情况及其对噻唑膦的敏感性，发现RNA干扰处理后抗性种群总AChE对噻唑膦的敏感性升高，噻唑膦对其抑制作用加强，进一步说明ace2在噻唑膦抗药性中发挥了作用。.（7）比较了RNA干扰后南方根结线虫抗性种群侵染能力，与对照组相比，经过Mi-ace-2a dsRNA浸泡处理的线虫对番茄根部的侵染力有所下降，但无显著性差异，说明ace2基因突变对根结线虫的侵染没有显著影响。.4、科学意义. 本研究发现根结线虫对根结线虫产生抗药性的机制主要是由于乙酰胆碱酯酶基因ace2发生突变，导致根结线虫对噻唑膦的敏感性降低，为减少噻唑膦的应用、制定合理的防治策略提供了理论依据。