基于MBD2和TET基因的含砷中药治疗骨髓增生异常综合征的分子机理研究

The efficacy of traditional Chinese medicine Qinghuang powder was even better than the latest drugs in treatment of myelodysplastic syndrome (MDS). Qinghuang powder was worth promotion because of safe and cheap. In our previous research, we have found that Qinghuang powder has the function of demethylation in MDS patients. By researching DNMT, we obtained that the function of demethylation of Qinghuang powder was not through the passive mechanism (inhibiting DNMT activity). Therefore, we will focus on active mechanism of DNA demethylation in MDS patients and MDS cell lines. The expression of mRNA and the protein of MBD2, TET1, TET2 and TET3, and the changes of 5mC and 5hmC will be investigated. On the base of Qinghuang powder reducing abnormal hypermethylation in MDS patients, we will investigate the effect of demethylation of PIK3R2 gene, and the influences of PIK3R2-PI3K / Akt- NF-κB in MDS cells by Qinghuang powder, to clarify the molecular mechanism of Qinghuang Powder in treating MDS patients.

含砷中药青黄散治疗骨髓增生异常综合征（MDS）疗效优于国外最新药物,且安全廉价。我们既往研究发现青黄散对MDS患者有去甲基化作用，通过对DNMT的相关研究，明确了青黄散的去甲基化作用不是通过被动机制（因DNMT活性受抑制导致新合成DNA链上甲基化缺失）起作用，因此本研究假设青黄散的去甲基化作用是通过主动去甲基化机制(通过MBD2和TET起作用)。通过对MDS患者和MDS细胞株的研究，探讨青黄散能否影响MBD2和TET1、TET2 和TET3的mRNA和蛋白的表达情况，以及5mC和5hmC的变化，明确青黄散治疗MDS的去甲基化作用机理；此外，在明确青黄散可以降低MDS患者的异常高甲基化水平的基础上，研究青黄散对PIK3R2基因的去甲基化作用，以及对MDS细胞PIK3R2—PI3K/Akt—NF-κB信号通路的影响，明确青黄散治疗MDS的分子机理。

前期研究表明，含砷中药青黄散治疗骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndromes, MDS）疗效确切，但作用机理尚未完全阐明，课题组前期研究发现青黄散可能会影响MDS的甲基化水平。本研究分两部分，临床研究部分：按计划纳入中国中医科学院西苑医院血液科门诊MDS病例31例，以青黄散为给药手段治疗患者6个月，总有效率为64.9%，通过不同治疗阶段血砷浓度的监测，明确了血砷浓度持续≥30μg/L时可维持较好疗效；通过荧光法DNA甲基化和羟甲基化试剂盒检测青黄散治疗前后MDS患者5m C 和5hm C的变化，进一步应用850K甲基化芯片（Illumina Infinium MethylationEPIC BeadChip）检测青黄散治疗前后MDS患者的全基因组甲基化水平，发现青黄散可双向调控MDS患者的全基因组DNA甲基化水平：既上调了部分基因的甲基化水平，又下调了部分基因的甲基化水平；以Real time PCR和Western blot检测MDS患者青黄散治疗前后骨髓单个核细胞中甲基化相关蛋白的表达情况，明确了青黄散可调控MBD2、DNMT、TET1、TET2 和 TET3的表达。细胞实验部分：通过CCK-8试剂盒，明确了青黄散主要组成分AS2S2和靛玉红作用MDS细胞的最佳作用浓度和作用时间；通过Real time PCR和Western blot实验验证了AS2S2和靛玉红能影响MBD2、DNMT、TET1、TET2、TET3、PIK3R2、PI3K、AKT以及磷酸化的PI3K、AKT和活化的NF-κB的表达。综上，本项目在既往研究的基础上，进一步验证了青黄散治疗MDS的有效率，明确了口服青黄散治疗的最佳血砷浓度；验证了青黄散可双向调控MDS患者的全基因组DNA甲基化水平（既能上调又能下调）；青黄散能影响甲基化相关蛋白MBD2和TET1、TET2 和 TET3的mRNA和蛋白的表达，通过细胞研究进一步验证了青黄散对MDS细胞PIK3R2—PI3K/Akt—NF-κB信号通路影响，阐明了青黄散治疗MDS的分子机理。