含砷中药青黄散对骨髓增生异常综合征（MDS）异常基因低甲基化与高甲基化双向调控作用的验证研究

Myelodysplastic syndrome (MDS) is one of common malignant tumors. Studies have shown that MDS exists a large amount of abnormal hyper-and hypo-methylated genes. At present, we just have the hypomethylating drugs and thus need to find a drug which has biphasic effects on DNA methylation to improve the effect in the treatment of MDS patients. Our previous studies have found Qinghuang powder have demethylation effect in the treatment of MDS, at the same time, we also found that after treatment with Qinghuang powder, the abnormal hypomethylated genes in MDS patients were corrected. Thus we assume that Qinghuang powder have the biphasic effects on DNA methylation in MDS patients . To prove this hypothesis, we will use Qinghuang powder to treat MDS cell lines F-36p and 10 patients with MDS, then Methylation chip, PCR and Western blot will be applied to prove Qinghuang powder can adjust the levels of abnormal hypermethylated and hypomethylated genes in MDS patients, the research will be a preliminary exploration for the development of drug which has the biphasic effect on the methylation in MDS.

骨髓增生异常综合征（MDS）为血液系统常见的恶性肿瘤之一。研究表明MDS同时存在大量异常的高甲基化基因与低甲基化基因，目前临床上仅有针对MDS异常高甲基化基因的去甲基化药物，因而需要寻找能够对MDS中异常高甲基化与低甲基化基因进行双向调控的药物，来提高临床治疗效果。MDS属中医髓毒劳病，前期研究发现青黄散具有显著的去甲基化效应，同时我们也发现经青黄散治疗后MDS患者异常的基因低甲基化现象也得到纠正。因而假设青黄散治疗MDS的机理不仅在于去甲基化，同时还有促甲基化的作用，即对MDS具有双向的甲基化调控作用。为验证这一假设，本次研究拟用青黄散处理MDS细胞株F-36P以及治疗10例MDS患者，运用甲基化芯片，PCR及western blot技术，试图揭示其通过调节MDS中异常基因的高甲基化与低甲基化水平来达到治疗MDS的新分子机制，为开发中医药甲基化调控药物作前期探索。

DNA异常的高甲基化与低甲基化是骨髓增生异常综合征（MDS）重要的发病机制之一。含砷中药青黄散方案能有效治疗MDS，前期研究初步发现青黄散方案对MDS异常的高甲基化与低甲基化具有双向的调控作用。在本次研究研究中，我们应用人甲基化850K芯片、PCR、WB等现代实验技术，对青黄散方案治疗MDS的双向甲基化调控作用进行验证。结果表明与正常人比较，MDS患者有大量异常的高甲基化基因与低甲基化基因，同时MDS患者的DNA甲基化转移酶（DNMTs）表达明显降低。给与青黄散方案治疗6月后发现，该方案能具有显著的甲基化调控效应，共有60个基因的甲基化水平升高，1个基因的甲基化水平降低，说明了该方案以促甲基化为主，去甲基化为辅；同时还发现，青黄散方案能显著提高MDS患者的DNA甲基化转移酶表达，显示该方案独特的作用机制。体外研究发现，青黛主要成分靛玉红不能抑制MDS细胞株SKM-1的增殖，对基因甲基化无调节作用；青黄散方案君药雄黄的主要成分As2S2对MDS细胞株具有显著的抑制作用；As2S2具有显著的甲基化调控效应，能诱导SKM-1细胞出现975个为高甲基化基因，57个低甲基化基因，显示As2S2 具有以促甲基化效应为主的双向甲基化调控效应，这与体内研究结论一致。同时2μmol/L As2S2 能够显著增加DNA甲基化转移酶的RNA与蛋白表达。在下游表达方面，Q-PCR显示2μmol/L As2S2增加低甲基化基因BRD7、TUSC3的RNA表达；对于高甲基化基因，2μmol/L As2S2升高WNT9b，GLUD1的RNA表达，相反，1与4μmol/L As2S2降低WNT9b、GLUD1基因的表达。WB显示，不同浓度As2S2增加了BRD7、WNT9b、GLUD1等基因的蛋白表达水平。As2S2能改变肿瘤相关基因的表达水平，但基因甲基化水平改变与其下游表达并非完全一致。总之，研究提示，青黄散方案具有独特的作用机制：促甲基化效应，这一作用机制不同于目前的去甲基化药物，未来我们将从MDS异常的低甲基化角度出发开发针对MDS的治疗药物，以弥补目前只有去甲基化而没有促甲基化药物的研究空白。