黑孢块菌发酵过程中VOSCs合成酶基因转录表达的调控机制

Volatile organic sulfur-containing compounds (VOSCs) as major contributors to the overall flavor are synthesized through Ehrlich and Demethiolation pathways, and Ehrlich pathway plays a main part during VOSCs biosynthesis. Metabolic process is the key step for controlling and optimizing flavor formation. While, little is known about pathway regulation mechanism mediating VOSCs biosynthesis. In previous work, the perturbation of VOSCs biosynthesis by chemical addition leaded to consistent changes in transcriptional expression pattern of synthase genes and VOSCs metabolites pattern. This suggested that pathway regulation of VOSCs biosynthesis depends on the control of the transcriptional expression of VOSCs synthase genes. This project aims to identify the expressional patterns and regulatory elements for VOSCs synthase gene promoters, screen the regulators involved in VOSCs biosynthesis and then infer the possible regulatory relationship among different regulators, which will reveal a hierarchical transcriptional regulatory network controlling the expression of VOSCs synthase genes. The results will promote the deep and systematic understanding of the molecular mechanisms that regulate VOSCs biosynthesis pathways.

微生物通过埃利希和脱巯基途径降解甲硫氨酸合成香味主体成份-挥发性有机含硫化合物(VOSCs)，其中以埃利希途径为主。代谢途径过程是控制和优化发酵体系整体香味形成的关键环节，但目前对VOSCs生物合成途径的调节机制尚不清楚。黑孢块菌是一种具有浓郁而独特香味的名贵食用真菌，前期通过外源添加化合物扰动黑孢块菌合成VOSCs，发现合成酶基因转录表达模式与VOSCs代谢流分布出现一致变化，推测合成酶基因转录表达调控是细胞调节VOSCs生物合成途径的关键分子机制。本项目拟鉴定黑孢块菌VOSCs合成酶基因启动子的表达模式和调控元件，筛选介导VOSCs生物合成的调节因子，明确调节因子的功能相关性，解析调节因子作用合成酶基因启动子进而控制基因转录表达的网状层级调控系统。研究结果预期将阐明VOSCs合成酶基因转录表达的调控机制，促进VOSCs生物合成途径分子调节机制的深入和系统理解。

黑孢块菌通过埃利希和脱巯基途径分解甲硫氨酸合成香味主体物质—挥发性有机含硫化合物(VOSCs，包括3-甲硫基丙醛、3-甲硫基丙醇，甲基硫醇、二甲基硫、二甲基二硫和二甲基三硫)，其中以埃利希途径代谢为主。代谢途径过程及其产物直接影响整体香味的形成，是控制和优化香味的关键因素。合成酶基因作为控制VOSCs生物合成的分子基础，其在转录水平的表达是控制VOSCs生物合成的关键环节。本项目主要解析了黑孢块菌发酵过程中VOSCs合成酶基因转录表达的调控机制。首先，获得与VOSCs合成相关酶基因的全长序列，通过分析相关酶基因的转录表达结合基因过表达手段，鉴定参与VOSCs生物合成的主效酶基因为氨基转移酶基因ARO8-2、脱羧酶基因PDC和脱巯基酶基因STR3；克隆主效酶基因启动子区，构建启动子与报告基因HPT融合表达载体，通过潮霉素抗性检测，发现启动子是控制主效酶基因转录表达的关键元件；鉴定主效酶基因ARO8-2、PDC和STR3的转录起始位点分别为T、G和A。其次，通过构建抑制性消减杂交文库对介导VOSCs生物合成的调节因子进行筛选，在正向文库中筛选到调节因子CP2T、F-box domain containing protein、PWWP domain-containing protein和Transcript antisense to ribosomal RNA protein，在反向文库中筛选到调节因子C6。最后，预测主效酶基因ARO8-2、PDC和STR3启动子上游调节元件，通过染色体步移结合调控元件缺失和突变，发现胁迫响应因子MSN2调控埃利希途径氨基转移酶基因ARO8-2和脱羧酶基因PDC在转录水平的上调表达，氮阻遏信号途径Msx通路调控脱巯基酶基因STR3在转录水平的下调表达。研究结果促进了VOSCs生物合成途径分子调节机制的深入和系统理解。