RpsA作为抗耐药结核杆菌药靶有效性确认及活性化合物发现

Pyrazinamide (PZA) is a first-line drug for tuberculosis (TB) treatment，which is hydrolyzed intracellularly to pyrazinoic acid (POA) by pyrazinamidase(PZase) to exert the therapeutic effect with the ribosomal protein S1 (RpsA). PZA-resistant TB mainly because of the lacking of PZase causing no hydrolysis of PZA and mutations of RpsA structure causing no interactions between POA and RpsA. This project studies the structure characteristics and differences between wild-type and mutation RpsA via structural biology methods, and discovers novel active compounds which can interact with all RpsA directly via medicinal chemistry methods. This will validate the RpsA as drug-resistant mycobacterium tuberculosis drug target and provide theoretical basis for further drug development.

吡嗪酰胺（PZA）是抗结核病一线药物，经吡嗪酰胺酶（PZase）水解为吡嗪酸（POA）与核糖体小亚基的第一个蛋白质RpsA作用发挥药效。其耐药菌主要是由于PZase缺失无法水解PZA和RpsA结构突变造成POA无法与受体结合而丧失疗效。本项目通过结构生物学方法研究野生型与耐药性RpsA的结构特点与差异，利用药物化学手段寻找和发现直接能与耐药型RpsA作用的活性小分子，确定RpsA作为抗耐药结核杆菌药物靶标的有效性，为进一步药物研发提供理论依据与指导方向。

为了确认针对Rps1作为抗耐药结核杆菌的有效靶点，利用生物信息学工具对野生型和两个耐药型Rps1 (MtRps1, MtRps1d438A and MsRps1)的晶体结构关键片段进行结构特点和差异分析，方法包括RMSD值评价、分子动力学优化、同源建模等。通过结构差异和对接数据分析，发现关键活性位点，建立合理的对接虚拟筛选模型。确定了两个结合位点(site1: Lys303、Phe310、Glu318、Arg357和 site2: Lys303、Phe307、Phe310、Glu318 、Arg357)，采用基于受体和基于配体的筛选。获得了26个化合物进行分子水平和细胞水平活性研究。采用饱和转移差谱(STD)的核磁方法、荧光滴定方法、生物膜干涉技术(BLI)、等温量热滴定技术(ITC)、化学位移扰动(CSP)的核磁滴定方法以及晶体学技术对26个化合物进行蛋白-配体相互作用研究，成功发现了8个化合物的解离常数在毫摩尔到微摩尔级别，进一步的细胞水平体外抑菌实验也确证了这8个化合物具有较高的抑菌活性，其中化合物ZRL7、8、11、20、25和26对结核分子杆菌全敏菌株(H37Rv)和三个PZA耐药菌株(PZA069、PZA080和PZA073)的活性最好，MIC均小于10ug/ml。.为了发现靶向RpsA的新颖化合物，我们依据RpsA结构和已有活性化合物，通过计算机辅助药物设计方法，对野生型和PZA耐药型的RpsA的第四个S1结构域和C-端晶体结构进行分析研究，确定关键活性位点。揭示了438位天冬氨酸缺失导致RpsA耐药的动力学机制，同时建立虚拟筛选模型，对多个化合物库进行虚拟筛选，设计并合成了20个候选化合物。然后通过应用多种分子生物学技术（STD、FQT、BLI、ITC、CSP和晶体学）在分子水平测定这些化合物与RpsA的亲和力，最终发现有6个化合物能够与两个靶蛋白结合，它们与野生型RpsA(MtRpsA)、耐药型RpsA(MtRpsAd438A)的解离常数均能达到µM级。.通过本课题的研究，再次确认了核糖体蛋白S1(RpsA)可以作为抗结核药物和抗耐药结核药物的有效靶点，揭示了438位天冬氨酸缺失造成PZA抵抗的内在机制，建立了合理的筛选模型。使用多种分子生物学技术筛选出了14个靶向RpsA的活性化合物，为进一步研究靶向RpsA的抗结核和抗耐药结核病药物研究提供了理