miR-135b/FoxO1/DSPP信号调控牙髓干细胞向成牙本质细胞分化的机制研究

Previous studies have shown that microRNA-135b negatively regulates odontoblast differentiation of dental pulp stem cells. In-depth study of the molecular mechanism of microRNA-135b involved in dental pulp repair, we found that microRNA-135b targeting inhibited FoxO1 translation. And in the process of differentiation of dental pulp stem cells into odontoblast cells, FoxO1 expression is up-regulated and it feedback promotes the differentiation process. Furthermore, FoxO1 activates the transcription of DSPP, a marker protein in the final stage of odontoblasts differentiation. Therefore, we hypothesize that there may be a mir-135b/FoxO1/DSPP signaling pathway targeting to regulate the differentiation of dental pulp stem cells into odontoblasts, which may be an important mechanism of repair and regeneration after dental pulp injury. In this project, Crispr/Cas9 and lentivirus transfection technology are used to clarify the role of Foxo1 in odontogenic differentiation and its effect on the expression of DSPP and related odontogenic signals. Immunoprecipitation and DSPP promoter mutation techniques are used to clarify the binding relationship and action sites between FoxO1 and DSPP, and to explore the molecular mechanism and pathway of mir-135b/FoxO1 influencing the differentiation of dental pulp stem cells by regulating DSPP and related signals. The results will provide a scientific basis for physiological restoration of pulp injury.

既往研究示miR-135b负调控牙髓干细胞向类成牙本质细胞分化。在深入研究miR-135b参与牙髓修复反应的分子机制时,我们发现其靶向抑制FoxO1翻译；FoxO1在牙髓干细胞向类成牙本质细胞分化时，表达上调且促进分化进程；进而又发现FoxO1激活成牙本质细胞终末分化阶段的标志蛋白DSPP转录。据此我们假设：可能存在miR-135b/FoxO1/DSPP信号通路靶向调节牙髓干细胞向成牙本质细胞分化，可能是牙髓损伤后修复再生的重要机制。为此，本项目拟用慢病毒过表达/低表达技术，阐明Foxo1在成牙本质向分化进程中的作用，明确其对DSPP及相关成牙信号表达的影响；采用免疫共沉淀及DSPP启动子突变技术明确FoxO1与DSPP的结合关系及作用位点；探索miR-135b/FoxO1通过调控DSPP及相关信号影响牙髓干细胞分化的分子机制及通路，为生理性修复牙髓损伤提供科学依据。

牙髓干细胞成牙本质向分化是牙髓受外界刺激时做出的防御修复反应。利用牙髓细胞的增殖、分化潜能诱导牙髓细胞成牙本质向分化来修复牙髓损伤是维持天然牙髓行使正常功能的重要治疗方法，目前该治疗方法适用范围仍然较窄，其原因是牙髓细胞成牙本质向分化的分子机制仍未阐明。课题组既往研究表明miR-135b负调控牙髓干细胞向类成牙本质细胞分化，通过对miR-135b下游靶基因的筛选发现，FoxO1在牙髓细胞中表达，并随着成牙本质向分化表达升高。利用miR-135b功能性表达实验发现，FoxO1表达与miR-135b负相关，据此我们推测FoxO1参与牙髓细胞成牙本质向分化。通过慢病毒转染构建FoxO1过表达/低表达细胞体系后，我们发现FoxO1上调DSPP、DMP1、OCN、BSA等成牙本质分化标志基因表达及细胞外矿化基质形成，在裸鼠体肾背膜下根管培养发现牙髓细胞高表达FoxO1促进矿化物、基质胶原及前期牙本质形成。在患龋牙齿及HA-TCP支架体内培养模型中发现牙髓组织在受到龋病刺激后高表达FoxO1，并且DSPP的高表达与FoxO1的高表达存在伴随现象。通过Jaspar软件预测及双荧光素酶报告基因实验发现，DSPP启动子区存在FoxO1转录结合位点。FoxO1是能量代谢核心元件，实验发现FoxO1增强细胞ATP代谢水平，削弱乳酸分泌，并促进牙髓干细胞发生线粒体转移。对转录组芯片的GO分析发现，FoxO1激活代谢相关基因转录，这些基因主要富集在能量代谢通路，提示FoxO1促进牙髓干细胞代谢表型从糖酵解向氧化磷酸化转换，这种代谢表型的变化有助于干细胞向功能性细胞分化。综上，FoxO1通过上调DSPP等成牙本质向分化关键基因表达及激活牙髓干细胞能量代谢途径，从而促进牙髓干细胞成牙本质向分化。采用小分子的miR-135b调节FoxO1表达可能是促进人牙髓细胞牙髓细胞成牙本质向分化的潜在策略。本项目成果丰富了牙髓干细胞在的功能性牙髓再生研究领域的的理论基础，为牙髓干细胞疗法的临床前探索提供参考价值。