定向改造菌果聚糖合成酶提高催化产物聚合度专一性的研究

已知的菌果聚糖合成酶的催化产物专一性都很差，可同时产生两种不同聚合度的菌果聚糖。两种聚合度菌果聚糖都非常重要，但其功用差异明显，而造成这种聚合度差异的机理尚不清楚。如果能提高催化产物聚合度的专一性，则可达到提高单一聚糖产率，并方便产物分离纯化的目的。由于目前还不清楚哪些氨基酸位点能影响该酶催化产物聚合度专一性，因此很难通过定点突变实现酶结构的定向改造。本研究拟采用分子定向进化实现这一目的。首先将针对现有建库方法的缺点建立并运用新的两步改组法实现基因改组库的构建，并采用特异于菌果聚糖合成酶而设计的多步筛选法实现对基因改组库的筛选。在此基础上还将通过改变催化方式(酶的固定化和通透性全细胞催化)和优化催化条件来进一步提高酶定向催化的效率，并为酶的实际应用摸索条件。本研究的实现也将有助于阐明造成该酶催化产物聚合度差异的机理；并进一步拓宽分子定向进化的应用范围，为相关研究提供有益参考。

菌果聚糖合成酶可以催化蔗糖产生不同聚合度的菌果聚糖、低聚果糖和单糖。目前已经报道的菌果聚糖合成酶的活性和催化反应产物的专一性都较差，因此获得高活性和高催化产物专一性的酶具有重要的意义。由于目前还不清楚哪些氨基酸位点能影响该酶的活性和催化产物专一性，因此很难通过定点突变实现酶结构的定向改造。而本研究致力于采用分子定向进化方法结合酶的固定化来实现这一目的。本研究的成果包括：建立起了高效的土壤DNA提取和基因克隆新策略，成功实现了菌果聚糖合成酶基因的克隆；建立了高效的两步改组法，并以融合DNA克隆方式成功实现了菌果聚糖合成酶基因改组库的构建；首次利用蔗糖存在下的条件致死特性实现了对有活性的菌果聚糖合成酶的筛选和选择；采用薄层析法结合高效液相色谱成功筛选获得了活性和聚合度专一性均有提高的菌果聚糖合成酶；通过改组酶的固定化和通透性全细胞催化提高了酶的催化活性和热稳定性。同时，本研究所涉及的相关技术对同类研究也有重要的借鉴价值。