红景天苷抗缺氧作用的分子靶点和信号途径研究

我国高原地区幅员广阔，是涉及国家战略资源和国家安全的重要地区。植物药红景天已应用于高原缺氧防治，但其主成分红景天苷作用的靶细胞、靶分子和信号通路尚不明确。我们分析了红景天苷的分子结构，可以在不破坏其活性位点的基础上将其固定于支持物，有利于亲和层析。我们拟分别以神经细胞、血管内皮细胞和心肌细胞缺氧损伤为模型，以亲和层析结合生物质谱的方法对红景天苷的分子靶点进行筛选，利用蛋白标记结合生物质谱定量蛋白质组学方法分析红景天苷作用的细胞磷酸化蛋白信号分子表达，应用cDNA芯片分析mRNA表达。通过对数据的生物信息学分析处理，将筛选到的红景天苷的可能分子靶点归属于不同的信号转导通路，应用分子生物学手段如基因沉默（RNAi）等方法对信号途径关键节点分子进行验证。旨在获得红景天苷→分子靶点→信号通路→效应蛋白→细胞功能调控的药物作用机制全景模式图。从而为红景天苷作为药物先导物的进一步研发应用提供科学依据。

以低氧诱导剂氯化钻处理心肌H9C2细胞，复制缺氧模型，应用MTT法观察红景天苷对缺氧导致的细胞生存的影响；以流式细胞术检测细胞死亡，以荧光双染观察细胞死亡的形态学特征，应用蛋白稳定同位素标记结合生物质谱（SILAC）方法定量检测差异表达的蛋白质，应用Western Blot等方法验证差异表达的蛋白。结果显示：选择1 nM-1000 nM剂量范围的SAL预处理细胞，24h后再进行模拟低氧发现，与低氧组相比，SAL预处理有显著的促心肌细胞增殖作用（P<0.01）。处理细胞24 h后用我们发现细胞的凋亡率显著增加（P<0.01）,同时与单纯用氯化钴处理的细胞相比，预先经红景天苷（10nM、100nM）处理的细胞的凋亡率显著降低，分别下降约10%和14%。稳定同位素标记结合生物质谱的蛋白质组学分析显示，对照组、缺氧组和红景天苷干预组共检测出蛋白质4344个，显著差异蛋白500余个，按与细胞功能的关系进行了分类，对有关信号途径蛋白分子的表达进行了验证。该研究结果表明，红景天苷能保护心肌细胞的缺氧损伤，该作用与多种信号途径有关，信号途径发挥的作用有待进一步证实。