白屈菜碱诱导人胃癌SGC-7901细胞M期阻滞及有丝分裂灾变死亡的研究

根据"热者寒之"的清热解毒中医疗法从清热解毒类中药中筛选抗癌活性成分并阐明其作用机理已成为抗肿瘤研究的热点。白屈菜碱为清热解毒类中药白屈菜的主要活性成分之一，曾作为止痛药应用于临床。近年研究发现其具有抗肿瘤作用，但作用机制尚未明确。本研究前期研究发现白屈菜碱能显著抑制多种人肿瘤细胞增殖，但机制与白屈菜中另一活性成分白屈菜红碱不同，并不诱导细胞凋亡，而是将细胞阻滞于M期，在形态学上出现体积变大，形成多核细胞等有丝分裂灾变死亡的特征。由此我们提出：白屈菜碱通过引起肿瘤细胞发生有丝分裂灾变死亡发挥抗肿瘤作用。本项目拟设计相关实验并采用LCSM、FCM、Western blot等方法印证上述假设的正确性。将在白屈菜碱对肿瘤细胞G2/M期DNA损伤检查点及纺锤体组装检查点的调控机制以及诱导肿瘤细胞发生有丝分裂灾变死亡的分子机制方面有所突破。课题研究成果将为白屈菜碱的药物开发及应用于临床提供理论依据。

近年来诱导肿瘤细胞发生有丝分裂灾难成为开发抗肿瘤药物的新分子靶向目标，为肿瘤化学治疗开辟了新的途径。本研究探讨白屈菜碱诱导人胃癌SGC-7901细胞发生M期阻滞和有丝分裂灾难作用及其机制，为白屈菜碱相关抗癌药物的研发及应用提供科学依据。采用MTT和SRB法检测及倒置显微镜观察白屈菜碱对SGC-7901细胞的生长抑制作用，测得IC50为17.90μmol/L，GI50为19.84μmol/L。Giemsa染色后发现随着给药浓度的增加多核大细胞明显增多，表现出有丝分裂灾难的特征。采用电镜观察细胞超微结构变化，结果显示白屈菜碱（10 µmol/L）作用24h可见细胞体积变大，细胞核膜包裹核质形成大小不一的多个微核。作用48和72h多核大细胞出现凋亡特征。对乳腺癌MCF-7细胞和肝癌HepG-2细胞也具有同样的诱导作用。流式细胞术分析结果表明白屈菜碱对SGC-7901细胞有G2/M期阻滞作用；Western Blot的方法检测结果显示白屈菜碱给药24h时可以上调pH3(ser10)组蛋白的表达，细胞阻滞于M期，给药时间增加该蛋白表达下调，细胞退出M期。.采用免疫荧光标记激光共聚焦显微镜观察发现白屈菜碱作用24h后能够抑制SGC-7901细胞微管聚合，破坏纺锤体微管结构，使细胞阻滞于M期。进一步采用Western Blot的方法检测不同时间点白屈菜碱对相关蛋白表达的影响。结果显示，给药24h可以上调cyclinB1蛋白表达，增加CDK1-cyclinB1复合物活力，SGC-7901细胞进入M期。48h和72h时，白屈菜碱可以显著性下调cyclinB1、CDK1和cdc25c蛋白表达水平。而此时细胞出现多核，则表明细胞出现有丝分裂滑行。白屈菜碱可下调Plk-1蛋白表达，上调Securin蛋白表达，导致细胞在有丝分裂时姐妹染色单体分离异常，发生有丝分裂错误，形成多核大细胞。白屈菜碱作用72h后，BubR1和Bub1蛋白表达显著降低，解除对APC的抑制，从而引发纺锤体检测点的妥协反应，细胞越过该检查点，滑脱至伪G1期，形成假G1细胞，发生有丝分裂灾难。这些细胞没有生存能力。研究发现给药24h后caspase3蛋白表达显著升高，表明经历有丝分裂灾难的SGC-7901细胞其中的一部分通过凋亡途径死亡。发表科技论文6篇，其中EI收录2篇。获黑龙江省高校科学技术二等奖1项；申请专利2项。