拟南芥磷脂酰肌醇3-激酶调控生长素极性运输与极性生长的分子机制

一类磷酸肌醇3-激酶（PI-3-kinase）信号转导途径决定动物激素引起的代谢、极性生长、细胞迁移等重要过程。三类（也是原始的）磷酸肌醇3-激酶则调控多种胞内运输途径。拟南芥基因组仅含有一个三类磷酸肌醇3-激酶（AtVps34），其反义RNA表达导致显著的生长抑制，敲除此基因则植物不能存活。AtVps34通过何种途径控制植物生长，目前还完全未知。我们建立了稳定的AtVps34 RNAi株系。第二代纯合子的极性生长异常，生长素极性分布发生了显著变化，而生长素分布的关键决定因子, 外运蛋白PIN1和PIN2的亚细胞极性分布发生了明显的改变。我们计划在拟南芥根尖细胞中解析AtVps34调控PIN亚细胞极性运输的机制，并在整株植物的水平上确立AtVps34在生长素引发的基因表达与极性生长中的作用。 研究成果将对回答植物与动物调控极性生长的信号系统如何平行而独特地进化这一基本生物学问题有重要意义。

动物和酵母中研究表明，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3KC3, VPS34）是液泡蛋白分选（VPS）、细胞自噬（Autophagy）等多种胞内运输过程的关键调控者，对维持细胞的正常功能至关重要。拟南芥唯一的VPS34（AtVPS34）因敲除致死而少有研究。项目前期建立了稳定的AtVPS34 RNAi株系，并发现AtVPS34可能与生长素极性运输有关。项目执行期间，首先获得了T3-T5代RNAi纯合株系，发现RNAi水平与植物器官大小正相关，并且RNAi主要影响细胞延展而非细胞分裂。随后发现RNAi株系根尖生长素水平低于野生型，而生长素响应强于野生型。生长素关键内运蛋白AUX1、外运蛋白PIN1、PIN2的蛋白水平在RNAi中均较低，在亚细胞水平上则均去极化。外加AtVPS34的产物PI3P可以部分恢复PIN蛋白的亚细胞极性定位，并部分回补表型。随后验证了AtVPS34作为VPS蛋白调控液泡蛋白定位、胞吞等过程的功能，并发现它通过影响PIN蛋白的胞吞、胞吐及在质膜上侧向流动，调控PIN蛋白亚细胞定位。通过一系列遗传学工作，发现AtVPS34为PIN1、PINOID两个生长素运输与植物形态建成关键基因的增强子，而在RNAi背景下分别敲除生长素合成基因TAA1或生长素受体TIR1都引发了幼苗根尖崩溃，强烈抑制了胚后器官发生。因此，AtVPS34通过调控生长素运输蛋白的积累与亚细胞极性定位，正调控生长素极性运输，参与器官发生与器官大小决定。与此同时，发现并系统研究了植物中从未报道过的PI3KC3的两个调控亚基，AtVPS38/AtUVRAG与AtATG14，以及两个磷酸肌醇3-磷酸酶（PI3Ptase），MTM1与MTM2。通过蛋白互作、亚细胞定位、遗传与生化分析等，分别确认了AtVPS38/AtUVRAG与AtATG14作为PI3KC3的调控亚基，分别指导AtVPS34参与液泡蛋白分选与自噬； MTM1与MTM2分别负调控液泡蛋白分选与自噬。在进行ATG14与MTM2的工作期间，还建立了一个新的植物内源自噬检测体系，能够很好地从细胞、生化水平上指示细胞自噬强度。现已完成三篇文章初稿，另外一篇初稿写作中。一篇相关工作在Plant Physiology审稿中(MS ID#: PLANTPHYSIOL/2012/212563)。申请专利一项。培养硕士研究生1名，现指导3名。