构巢曲霉Calcineurin和CchA参与菌丝极性生长的分子调控机制

Polarity growth as an important step of morphogenesis in filamentous fungi, is regulated by calcium signaling cascade. Our previous study has been demonstrated that the polarity growth defects in calcineurin deletion strains can be rescued in the absence of cchA under salt stress, suggesting that the calcineurin and cchA might act as backward-acting regulator in hyphal growth of A.nidulans in the calcium signaling pathway in the response to salt stress. In this project, we will further investigate the biological function of Calcineurin and CchA and explore the molecular mechanism of Calcineurin and CchA in the regulation of polarity growth from the following three aspects: ①Analyze the impact of calcium homeostasis on hyphal growth recovery by real-time monitoring of the cytoplasmic Ca2+ and the transcription levels of the calcium transporters;②Clarify the relationship of mycelial growth and the polar distribution of cytoskeletal proteins and calmodulin at hyphal tips in single and double mutants;③Verification the rescue of hyphal growth defects maybe through coupling related pathways such as Rho-GTPase, MAPK and salt stress response pathway. Our study would like to validate the mechanism of complex signaling network mediated by calcium signaling pathway cooperate to regulate polarity growth. Nevertheless, our findings in this study will provide new insight into the basis for cellular function of calcium signaling system and understanding the mechanism of morphogenesis will better control the growth and reproduction of fungi and be of great help in finding novel drug therapies for fungal infections.

极性生长作为丝状真菌形态建成的重要环节，受到钙信号通路调控。申请人预实验发现：在盐逆境下，钙通道蛋白CchA缺失能恢复钙调磷酸酶Calcineurin敲除菌株的生长缺陷,提示它们反向调节了菌丝的极性生长。为此本项目以构巢曲霉Calcineurin/CchA单敲和双敲菌株为材料，分析Calcineurin/CchA的生物学功能，并从以下三方面探讨它们对菌丝极性生长的调控机制：①测定胞内钙流动态变化和钙转运体转录水平，分析钙离子稳态对菌丝极性恢复的影响；②检测骨架蛋白actin和钙调素的极性分布，探讨其与菌丝极性生长的关系；③检测Rho-GTPase、MAPK等旁路偶联通路的激活情况，探明钙信号通路相关功能网络共同调控菌丝极性生长的分子机制。本研究有望为解析丝状真菌的形态建成调控网络提供理论基础，并筛选出新的真菌特异性药靶，为真菌感染防治提供新策略。

在真核生物中，依赖钙离子/钙调素的蛋白磷酸酶calcineurin在应对环境变化以及适应环境过程中起到了重要作用。钙调蛋白磷酸酶calcineurin和钙通道蛋白CchA是钙信号通路的主要组分，它们两者之间是如何调控并响应非生物逆境胁迫的具体机制并不十分清楚。在本研究中，我们发现：在盐逆境下，CchA的缺失恢复了Calcineurin 单敲菌株的极性生长缺陷。同时，calcineurin单敲菌株对胞外钙离子、细胞壁破坏试剂Congo Red和CFW等的敏感性可以通过CchA的缺失而得到弥补，由此也反映 Calcineurin 和 CchA反向调控了菌丝极性生长和细胞壁的合成。为了探究盐逆境下胞内钙稳态是否参与了双敲菌株极性生长的恢复，本研究将可以与钙离子特异性结合的水母荧光蛋白在曲霉中进行表达，从而可以实时监测胞内钙离子浓度的动态变化。实验发现，在正常培养的细胞中，Calcineurin可以反向调控CchA介导的外源钙离子进入胞内。然而，当受到盐逆境刺激后，无论是缺少Calcineurin或者是CchA，都会导致胞内钙离子浓度下降，而同时缺少Calcineurin和CchA后，则可以使胞内钙离子浓度恢复至野生型菌株的正常水平，表明Calcineurin和CchA在盐逆境下协同调控胞内钙离子稳态来影响菌丝极性生长。此外，通过荧光定量PCR检测发现，enaA和hogA在双敲菌株中发生高调，我们推测这些基因的上调有可能代偿性地增加了双敲菌株对高盐逆境的耐受性。同时，YvcA作为TRP家族的一员，参与了盐逆境下极性生长的恢复，从而弥补了Calcineurin-CchA信号通路缺失在应对盐逆境胁迫中的生长缺陷。为了更好地解析Calcineurin反向调控CchA响应盐逆境胁迫的转录机制，本研究通过高通量转录组分析寻找参与双敲菌株极性生长恢复的特异表达基因DEGs。经分析发现，在双敲菌株中，次级运输蛋白上调倍数最高，同时还有36个盐逆境响应基因也发生特异性地高调，我们推测这些基因的上调也有可能导致双敲菌株对盐逆境的耐受性增强。进一步对双敲菌株中特异表达基因DEGs的功能学分析表明，转运系统、蛋白结合系统（热休克蛋白和蛋白酶体）以及细胞分裂生长过程等参与了对盐逆境胁迫的响应，也为在双敲菌株在盐逆境下极性生长恢复起到了一定的研究作用。