Caspases切割ARF-BP1调控p53信号通路的机制

The tumor suppressor p53 plays a key role in mediating DNA damage and oncogene activation induced tumor cell cycle arrest and/or apoptosis. ARF-BP1 is an E3 ligase of p53 and a major negative regulator of p53. ARF-BP1 mediated ubiquitination of p53 results in proteasomal degradation of p53, inhibiting the tumor suppressive function of p53. However, the mechanism that controls the activity of ARF-BP1 and how this affects the function of p53 are not well understood. In this study, we found ARF-BP1 is a substrate of caspases. Caspases control the activity of ARF-BP1. We found ARF-BP1 was cleaved in response to various apoptotic stimuli (including UV irradiation, TNFα﹢CHX stimulation, treatments with Taxol, Etoposide(VP16) and Cisplatin). Cleavage of ARF-BP1 occurred in several different tumor cell lines (Hela, Jurkat, MCF-7 etc.) undergoing apoptosis. The caspase inhibitor z-VAD-fmk prevented the cleavage of ARF-BP1, suggesting the cleavage was indeed mediated by caspases. After mutations of a couple of potential caspase cleavage sites, we identified a caspase cleavage site DYPD2473↓M in ARF-BP1. In future study, we will identify the other caspase cleavage sites in ARF-BP1, and characterize which caspase is responsible for the cleavage of ARF-BP1. Caspases-mediated cleavage might result in ARF-BP1 degradation, which will enhance p53 induced tumor cell death. We will investigate how caspase-mediated cleavage of ARF-BP1 regulates the tumor suppressive function of p53 and its relevance in tumorigenesis.

ARF-BP1是抑癌基因p53的主要负调控者之一，通过泛素化修饰降解p53. 但对ARF-BP1的调控以及这些调控如何影响p53的功能却知之甚少，亟待深入研究。本申请项目发现ARF-BP1是一个新的重要caspase底物。caspase切割ARF-BP1可能调控p53的肿瘤抑制功能。前期工作中我们发现不同细胞凋亡刺激均导致caspase切割ARF-BP1，可能引起ARF-BP1降解，增强p53诱导的肿瘤细胞凋亡。我们还鉴定到一个caspase切割位点DYPD2473↓M. 未来将利用PCR点突变鉴定其它切割位点，及体外切割实验确定切割ARF-BP1的具体caspase. 并将切割位点突变的ARF-BP1转染细胞，研究其如何影响p53信号通路及改变肿瘤细胞凋亡。我们的发现不仅揭示了ARF-BP1及p53功能调控的一个重要机制，还将对设计新的肿瘤治疗方法和药物具有积极意义。后续研究争取新突破。

抑癌基因p53诱导肿瘤细胞周期阻断、细胞凋亡和细胞衰老。在50%以上的肿瘤中p53基因都发生了突变。在正常细胞中p53的水平维持在最低水平；但当细胞受到DNA辐射、化学诱变剂作用、癌基因活化等破坏，细胞应激信号使p53水平迅速升高，p53的肿瘤抑制功能被激活。细胞通过泛素化修饰机制调控p53的水平。MDM2和ARF-BP1是降解p53的两个主要E3 ligases，它们控制p53的水平。其中ARF-BP1是一个4374氨基酸、含HECT结构域的E3泛素化连接酶. .虽然ARF-BP1调控p53的肿瘤抑制功能，但什么机制控制ARF-BP1本身的功能却不清楚。本项目发现了调控ARF-BP1功能的一种重要机制：caspases 调控ARF-BP1的功能。.项目发现DNA损伤引起肿瘤细胞凋亡时，caspases对ARF-BP1进行了切割，使ARF-BP1蛋白在SDS-PAGE中呈现数个片段；不同细胞凋亡刺激均产生了此种现象。当用z-VAD抑制caspases的活性，ARF-BP1蛋白切割现象消失，说明确实由caspases切割ARF-BP1。通过基因工程技术在大肠杆菌中表达纯化了重组caspases-3,-6,-7,-8；caspases体外切割实验（in vitro cleavage assay）证实了ARF-BP1是caspases底物；并且发现caspases-3,-6,-7负责切割ARF-BP1，而caspases-8则不切割ARF-BP1. 利用PCR点突变(site-directed mutagenesis)等分子生物学技术，对ARF-BP1蛋白从N-末端到C-末端不同结构域的研究，成功鉴定了DLPD1193、DYPD2473、D2752和 LSPD3664等主要四个caspases切割位点。.基于项目的发现，我们提出以下调控机制: 当DNA损伤发生时，p53通过线粒体通路激活caspases；而随后caspases对ARF-BP1的切割失活了p53的一个主要负调控者，从而形成了正反馈，使p53的水平迅速升高，导致细胞凋亡发生。简而言之，Caspases可能通过切割ARF-BP1导致其降解，从而解除ARF-BP1对p53诱导肿瘤细胞凋亡功能的抑制。 .项目的发现进一步说明抑癌基因p53的功能调控存在许多复杂层面，还有许多新机制仍有待继续深入探索研究。