鱼类弹状病毒核蛋白N的caspases切割机制及对病毒复制和致病性影响的研究

一些病毒在感染细胞的过程中能激活caspases酶并诱导细胞凋亡，而激活的细胞caspases酶又能对病毒蛋白进行特异性的切割，目前发现这种切割效应会影响到病毒的复制或致病性。但目前弹状病毒这方面的研究却尚未见报道。申请人前期的研究表明，鱼类弹状病毒的核蛋白N切割同激活的caspases酶存在一定的联系。本项目拟通过定点突变、FLICA和Western blotting等技术研究N蛋白的特异性切割机制，并以SVCV弹状病毒为模型鉴定其N蛋白的特定caspases酶切位点，结合病毒滴度测定和qRT-PCR阐明N蛋白切割对子代弹状病毒复制的影响。进一步利用定点突变和反向遗传系统，构建能表达N蛋白caspases酶切位点突变体的重组SVCV病毒，感染鲤鱼后分析核蛋白N的caspases切割对弹状病毒致病力的影响。本项目的完成将为理清鱼类弹状病毒的致病机理和诱导宿主细胞凋亡机制等研究提供理论基础。

在国家自然科学青年基金（N0.31101931）的资助下，我们以鱼类弹状病毒为研究对象，鉴定了其核蛋白N的caspases切割，初步确定了具体的切割位点，分析了该切割效应对子代病毒复制的影响。在此基础上，开展了一些弹状病毒诱导鱼类细胞自噬和凋亡相互作用关系的研究，为后续深入研究弹状病毒的致病机理奠定了基础。.一、主要研究结果：.（1）以鱼类弹状病毒（Siniperca chuatsi rhabdovirus, SCRV）为主要对象，克隆并成功构建了其N基因不同片段长度的pEGFP-N3真核和全长片段的pET32a原核表达载体，并制备抗N蛋白血清。合成特异性的N基因的siRNAs分子，转染细胞后进行病毒感染，检测发现抑制N蛋白的表达导致子代病毒滴度的降低。SCRV感染EPC等细胞系后，Western blotting检测到N蛋白出现特异性切割，N基因转染EPC细胞后也证实出现切割现象，且N基因siRNA能抑制N蛋白的切割。.（2）Caspases酶抑制剂z-VAD-FMK处理EPC细胞后，在SCRV病毒感染或其N基因转染条件下，发现其N蛋白的切割均被抑制，提示caspases酶介导了N蛋白的胞内切割。.（3）将不同长度的N基因缺失片段的pEGFP-N3重组表达载体转染细胞后，Western blotting鉴定其caspases切割位点，根据caspases酶切特点和N基因片段表达情况初步证实在D324和D374氨基酸位点进行了特异性的切割。.（4）z-VAD-FMK处理SCRV感染的EPC细胞，能明显抑制细胞病变的发生，但子代病毒滴度测定显示病毒的复制量并没有产生明显变化，这与以前有关哺乳动物弹状病毒VSV的报告一致。.（5）初步开展了SCRV病毒诱导细胞自噬的研究，吖啶橙染色分析SCRV感染后细胞有自噬泡出现。SCRV感染后的EPC细胞内LC3-II表达逐渐增多，表明SCRV诱导细胞自噬的发生。.二、取得的主要成果：.（1）明确了鱼类弹状病毒感染过程中其N蛋白的caspases切割现象和具体切割位点，证实了其对子代病毒复制的影响，并初步探讨了弹状病毒诱导细胞自噬的相关机制。.（2）依托该基金资助，目前以第一作者身份发表SCI刊源论文4篇，中文核心期刊论文3篇，合作发表中文核心期刊论文1篇。.（3）培养硕士研究生2名。