补肾活血法促进脂肪源性成体干细胞构建组织工程软骨的实验研究

本项目以腺病毒5(Ad5)为基因载体，以人转化生长因子β2(hTGF-β2)基因为靶基因，以脂肪组织源性成体干细胞（ADSCs）为种子细胞，以PLGA-藻酸钙为三维支架，构建"rAd5-hTGF-β2-ADSCs/PLGA-藻酸钙"复合体，分为四组：空白对照组(支架+ ADSCs)、基因转染组(支架+ ADSCs+ Ad5基因转染)、中药组(支架+ ADSCs+中药)和基因转染+中药组(支架+ADSCs+Ad5基因转染+中药)。各组细胞-支架复合体经体外培养后，植入裸鼠体内，继续体内实验。中药干预组：体外实验，培养基中添加补肾活血中药含药血清；体内实验，裸鼠补肾活血中药水煎剂灌胃。分别以组织学检查、免疫组化、原位杂交和RT-PCR检测复合体中软骨细胞、粘多糖、Ⅱ型胶原、蛋白聚糖及其基因的表达，观察中药对组织工程软骨生成的影响，阐明中药促进组织工程软骨构建的机制，为其建立一种新的构建方法。

目的：研究脂肪源性成体干细胞（ADSCs）体外增殖特性、表型特征及多向分化能力，探索补肾活血中药干预对组织工程软骨构建的作用及其机制。.方法：取SD大鼠双侧腹股沟部的脂肪垫，分离培养ADSCs，以流式细胞仪检测原代ADSCs和筛选标志物表达。在二维培养的方式下将大鼠ADSCs进行成脂、成骨、成软骨、成神经元诱导，观察其成脂、成骨、成软骨、成神经元能力并予以鉴定。构建携带hTGF beta2基因的5型复制缺陷型病毒,基因增强合并补肾活血中药含药血清干预体外培养的ADSCs向软骨细胞分化：分为四组：空白对照足组、单纯中药组、基因转染组和中药+基因转染组。通过形态学观察、行HE、甲苯胺蓝染色、PCR、WB及II型胶原和蛋白多糖免疫组化染色鉴定软骨细胞表型。上述处理的各组ADSCs体外诱导7天后接种PLGA/藻酸钙复合物三种支架材料，并手术置于BALB/C裸鼠皮下，补肾活血法予以干预，体内培养12周后取材，标本处理，行上述检测。.结果：从SD大鼠脂肪组织可以获得纯度较高的ADSCs，而且具有良好的增殖能力，能够进行传代培养并能保持其特性。流式细胞仪检测显示CD45、CD106呈阴性表达，CD29、CD44、CD90呈阳性表达。在二维培养环境中，大鼠ADSCs经过成脂、成骨、成软骨、成神经元诱导和组织学、免疫组化鉴定，均成功获得目的细胞。体外实验中基因转染组和中药+基因转染组的ADSCs在诱导14天后细胞爬片经甲苯胺兰染色和II型胶原蛋白免疫细胞化学染色呈阳性，经aggrecan细胞免疫荧光检测见细胞的胞浆、胞膜均有绿色荧光表达，而空白对照组和单纯中药组则仅维持贴壁生长，其标本在14天后经甲苯胺兰染色、II型胶原蛋白免疫细胞化学染色和aggrecan细胞免疫荧光检测，其结果均为阴性；同时RT-PCR和Westem-blot检测发现2周时中药+基因转染组较基因转染组标本中Col2al、hTGFbeta-2和aggrecan的mRNA和蛋白的表达水平上调（P<0.05），空白对照组和单纯中药组中无表达。细胞／PLGA复合体植入裸鼠皮下，其标本在12周后经甲苯胺兰染色、II型胶原蛋白免疫细胞化学染色和aggrecan细胞免疫荧光检测，其结果均为阴性；同时RT-PCR和Westem-blot检测发现12周时中药+基因转染组较基因转染组标本中Col2al、hTGFbeta-2和aggr