油水界面上酶蛋白与脂质分子间相互识别及作用的分子机理研究

The unique interface activation character of lipase indicates the existence of oil-water interface play a very important role for its activity. But little information could obtain with regard to the mutual recognition and the molecular mechanism between enzyme and lipid molecules on oil-water interface. Based on the established lipase interface catalysis theory and the unique advantages of single molecular layer technology to study of interfacial reaction process, present project will in-depth analysis of interfacial reaction between the enzyme protein and lipid single molecule on the process of monolayer adsorption and subsequent catalytic reaction. We choose the lipase G as enzyme represent, and phospholipid and glyceride as representative of lipid molecules. The mainly contents including research on the enzyme adsorption dynamic characteristics to the oil-water interface; Determine the key elements on enzyme that act on the protein interface recognition and further study the effect of lipid composition and protein structure changes on the adsorption process. Meanwhile, effects of changes on structure of protein and lipid monolayer composition for enzyme catalytic reaction kinetics will also investigate. By observation on the opening and closing state of lid structure on lipase, we will further elucidate the regulation mechanism of various factors on the enzyme catalytic activity. Further comprehensive analysis of the above two processes, we want to summarize the main factor and related mechanism at the interface that could modulate the catalytic reaction process. Present study will further improve our understanding on the catalytic reaction theory of lipase on oil-water interface.

脂肪酶独特的界面激活现象表明油水界面的存在对于活性发挥起非常重要作用。但目前对于油水界面上酶蛋白与脂质分子的相互识别及作用分子机理方面可获得的信息还比较少。本项目以脂肪酶界面催化反应理论为基础，充分利用单分子层技术在研究界面反应过程中的独特优势，深入剖析界面反应过程所涵盖的酶蛋白与脂质单分子层界面吸附及后续催化反应过程中酶与脂质分子间的相互作用。选取典型的脂肪酶作为酶代表，以磷脂和甘油酯为代表性脂质分子。尝试分析酶蛋白在油水界面上的吸附动力学特征；确定酶蛋白界面识别关键元件信息以及脂质组成及蛋白结构变化对于吸附过程的影响规律；考察蛋白结构及脂质单分子层组成变化对于酶蛋白催化反应动力学的影响；通过观测酶蛋白盖子结构的开合状态进一步阐明其对于酶催化活性的调控作用。通过对上述两个过程进行综合分析，总结在界面催化反应过程中的主要影响因素及作用机制，进一步完善酶蛋白在油水界面上的催化反应理论。

界面酶独特的反应模式包含了界面吸附和界面催化两个连续的过程。但目前对于油水界面上酶蛋白与脂质分子相互识别及作用分子机理方面信息较为缺乏。本项选取禾谷镰孢菌来源脂肪酶GZEL及两种弧菌来源磷脂酶D（VpPLD和VhPLD）作为界面酶代表，借助单分子层技术的独特优势，深入剖析界面反应过程中酶蛋白与脂质分子间的相互作用。具体开展研究内容及取得成果如下：引进并搭建起相对完善的单分子层技术平台，实现分子水平表征油水界面上酶蛋白与磷脂底物相互作用，为探明酶蛋白结构功能关系机理奠定重要基础；在脂肪酶GZEL研究方面：（1）发现GZEL的多功能催化特性；（2）总结获得不同类型及浓度表面活性剂对GZEL酶活力及其最适反应pH的影响规律；（3）获得不同外界环境因素对GZEL界面吸附特性的影响规律信息；（4）阐明C-末端肽段对酶活性的调控功能并提出相应作用模型；（5）探明D265是调控GZEL最适反应pH的关键位点；（6）发现GZEL在植物毛油脱胶应用中降低能耗的突出优势，并改造获得了酶活力及最适温度同时提高的突变体。在哈维氏弧菌来源PLD（VhPLD）研究方面：（1）成功构建VhPLD的重组表达菌株并获得基本酶学特性信息；（2）总结获得初始表面压力条件对VhPLD界面吸附动力学参数的影响规律；（3）发现C-末端12个氨基酸(472–483)肽段对VhPLD的酶学特性具有重要影响；（4）证实N-端肽段缺失（25-39）能显著提升酶蛋白催化活性。在副溶血弧菌来源磷脂酶D（VpPLD）研究方面：（1）发现(His)6-tag位置对于重组表达VpPLD蛋白的酶学特性产生较大影响；（2）删除VpPLD N-末端前34个氨基酸能显著增强VpPLD对DMPS底物的水解活性；（3）证实C-末端肽段(451-469)对VpPLD的底物选择性发挥重要影响作用。项目执行期内，发表论文8篇，其中SCI论文5篇，获授权专利3件；培养研究生4名。项目的开展，为系列酶蛋白与脂质分子在油水界面上的相互作用研究提供平台性的技术和方法；解析酶蛋白与脂质分子相互识别的关键元件信息及其相互作用规律，对于指导相关酶的基因工程改造有较好的科学价值和意义。