Aβ-铁卟啉复合物催化神经系统蛋白质酪氨酸硝化修饰的反应特性与生理影响

研究表明老年痴呆症(AD)脑中蛋白质酪氨酸硝化水平显著提高，但其机理不明了。近年来发现β-淀粉样蛋白(Aβ)和血红素可形成复合物。我们前期研究发现该复合物在活性氧存在下，可高效催化亚硝酸盐硝化蛋白质酪氨酸残基。结合AD脑中存在Aβ沉积，血红素、活性氧和活性氮水平高的特点，我们推测Aβ通过和血红素形成复合物而催化蛋白质酪氨酸硝化，是AD脑中蛋白质硝化水平高的原因，也是Aβ引起AD的发生发展的原因之一。为证实这个假说，本项目拟先研究Aβ和血红素结合的规律及Aβ-血红素复合物的特性，再选择几个AD脑中已知易于发生硝化的蛋白，研究Aβ-血红素复合物的催化硝化规律、硝化对这些蛋白质结构和功能的影响，最后在神经细胞上验证该复合物对细胞蛋白质的硝化及其对细胞生长的影响。本课题将从新的角度，研究Aβ和血红素引起老年痴呆症的新机理，并可能为防治AD提供新思路

本项目通过设计选取不同Aβ肽段以及突变Aβ，采用毛细管电泳、蛋白印迹、LC-MS/MS等技术，系统研究了不同的Aβ肽与heme相互作用的特性及所形成复合物的过氧化物酶活性，heme抑制Aβ聚集及解离Aβ聚集体的机理，Aβ-heme复合物催化脑中易硝化蛋白的硝化活性及对蛋白质功能的影响，以及Aβ与heme结合后对heme催化的蛋白质硝化的位点选择性的影响，并探讨了该复合物对神经细胞的影响。结果表明，不同Aβ与heme结合特性的不同对所形成的复合物的过氧化物酶活性有一定的影响，但这种促进过氧化物酶活性的作用与Aβ是否聚集无关。通过选取不同长度以及定点突变的Ab肽段，测定它们分别与heme结合后的过氧化物酶活性，发现Aβ的亲水N-端参与了与heme的结合，苯丙氨酸F19和/或F20与heme有相互作用，且F19和F20对Aβ-heme的过氧化物酶活性至关重要，heme抑制Aβ的聚集至少是与亲水端组氨酸结合及与疏水端苯丙氨酸共轭两者的共同结果；Aβ-heme催化烯醇酶及突触体蛋白硝化的能力显著强于heme；通过对硝化位点检测，发现heme催化的烯醇酶硝化主要发生在疏水环境中的酪氨酸Y12，而Aβ-heme则选择性地催化硝化烯醇酶亲水环境中的Y191及Y426，表明Aβ与heme的结合改变了heme催化蛋白质硝化的位点选择性。通过选取另一个AD中硝化显著增强、既具有分布于相对亲水环境中的酪氨酸，也具有分布于相对疏水环境中酪氨酸的蛋白质GAPDH，作为靶蛋白，设计三个具有不同亲疏水性的Aβ肽段，研究它们与heme结合后的复合物催化GAPDH硝化的选择性与其亲疏水性之间的关系，结果证实这种特异性结合可能导致位点特异性地催化产生活性氮物种，进而导致附近的酪氨酸优先地被硝化。细胞水平上的实验发现复合物不能进入细胞而引起胞内组织硝化，但胞内复合物的形成所产生的硝化影响不可忽视；发现Aβ的硝化有利于降低Aβ的细胞毒性。本课题结果为Aβ和血红素引起老年痴呆症提出新的机理假说，同时为研究蛋白质选择性硝化的规律提供参考。