m5C调控mRNA翻译的功能研究

Translation of mRNA is the process of protein polypeptide synthesis based on mature mRNA templates. Translation regulation is important in eukaryotic gene expression regulation, during which translation initiation factors play important roles. Recent research has shown that RNA methylation such as m6A can participate in translation regulation. m5C is another widespread RNA methylation, however, its function in the mRNA remains obscure so far. In our preliminary progress, we found that knockdown of NSUN2, one of the m5C methyltransferase, affects the translation efficiency of mRNA. Meanwhile, we also found several translation initiation factors may be potential m5C binding proteins, suggesting that m5C may be involved in mRNA translation regulation by modulating translation initiation factors. By integrating multi-cross-disciplinary technologies, including molecular and cellular technology, ribosome profiling, high throughput m5C-BS-seq and bioinformatics etc., we aims at identifying translation initiation factors binding with m5C, and unveiling the affect of m5C modification on the function of translation initiation factors. Clarifying the mechanism of m5C modification in mRNA translation regulation will provide compelling evidences directly supporting that m5C in mRNA as new cis-regulatory elements, and provide important insights into the mechanistics of RNA epitranscriptomes.

mRNA的翻译是指细胞以成熟的mRNA为模板合成蛋白质多肽链的过程。翻译水平的调控是真核基因表达调控的重要环节，翻译起始因子在翻译调控中发挥着重要作用。近期研究表明，RNA甲基化如m6A可以参与mRNA的翻译调控。m5C是RNA上另一种广泛存在的甲基化修饰形式，然而到目前为止，它在mRNA中的功能尚不清楚。在前期研究中，申请人发现m5C甲基转移酶NSUN2的敲低会影响到mRNA的翻译效率，同时还发现m5C的结合蛋白中含有多种翻译起始因子，这表明m5C可能通过与翻译起始因子相作用参与mRNA的翻译调控。本项目结合分子细胞、核糖体谱、高通量m5C重亚硫酸盐测序和生物信息学多学科交叉技术，鉴定与m5C相结合的翻译起始因子，解析m5C修饰对翻译起始因子功能的影响，阐明m5C修饰调控mRNA翻译的作用机制，为m5C修饰作为mRNA新顺式调控元件和揭示RNA表观转录组学核心规律提供理论依据。

首先揭示了m5C甲基转移酶NSUN2调控mRNA的翻译效率。通过质谱技术发现NSUN2与核糖体大小亚基及翻译起始蛋白存在相互作用，进一步通过核质分离及核糖体印记技术发现NSUN2在细胞核及细胞质中均有分布。通过新蛋白合成实验发现NSUN2的敲低显著降低了翻译效率。通过PARCLIP-seq结合公共数据库的核糖体印记测序数据，分析发现NSUN2的靶基因的翻译效率明显高于其非靶基因的翻译效率，并且通过单基因水平蛋白印记杂交实验验证了这种机制。进一步实验发现NSUN2可以和EIF3B相互作用，提示NSUN2可能通过与EIF3B相互作用调控蛋白的翻译过程。.我们同时揭示了m5C对mRNA稳定性和肿瘤发生调控的分子机制，明确了m5C通过影响RNA加工代谢调控疾病发生的分子机理。研究首次揭示了新的m5C结合蛋白YBX1可以通过m5C依赖的方式调控mRNA的稳定性，进而调控膀胱癌的增殖和转移。首先建立了膀胱癌组织中mRNA上的m5C单位点图谱，并发现癌症中m5C高甲基化修饰基因富集在癌症相关通路，同时这些呈现高甲基化修饰基因其表达也以上调为主。为了揭示m5C对基因表达的正向调控机制，进一步利用Oligo-pull down结合质谱、蛋白结构解析技术和高通量测序技术发现了细胞质内新的m5C结合蛋白YBX1，其中W65是YBX1识别mRNA m5C的关键氨基酸，并且YBX1以m5C依赖的方式调控mRNA稳定蛋白ELAVL1的RNA结合能力。相比于癌旁组织，m5C甲基转移酶NSUN2和m5C结合蛋白YBX1在膀胱癌组织中高表达。进一步通过体内、体外小鼠成瘤和转移实验及高通量测序技术，证明了NSUN2和YBX1以m5C依赖的方式促进HDGF mRNA的稳定性并最终促进膀胱癌肿瘤的增殖和转移。研究首次揭示了mRNA上m5C调控膀胱癌发生的分子机制，在新的层面上揭示了mRNA m5C修饰作为新的调控手段调控肿瘤的发生，这种转录后修饰可能在其他肿瘤疾病中也发挥着重要作用。