细胞内糖基原位分析新方法研究

Glycan is an important tumor marker molecular. Development of in situ analysis methods of cellular glycan is important for research of glycan related biological mechanism and diagnosis and treatment of tumor. In view of the developed in situ analysis methods of cellular glycan are limited to the cell surface glycan, this project proposes novel methods for analysis of intracellular glycan by design of new glycan responsive probes. An intracellular glycan responsive nanoprobe is firstly composed with introduction of signal amplification mechanism for highly sensitive imaging of intracellular glycan. Novel linear biological molecular probes are designed. The assembly and distribution of the biological molecular probes can be affected by the intracellular glycan, which can be in situ monitored by the super resolution total internal reflection fluorescence imaging and dark field imaging technology. By comparing the two dimensional signal variation in cell and vitro, a heterogeneous quantification mechanism can be established, which can be used for in situ quantification of intracellular glycan within single cell. This project is promising to provide important information for the fundamental research of glycan related biological processes, and beneficial to reveal the mechanism of formation and development of tumor, which can provide positive guide and promotion for diagnosis and treatment of tumor diseases.

糖基是一种重要的肿瘤标志物分子，发展糖基细胞原位分析方法，对于糖相关的生物学机理研究、肿瘤的诊断和防治等方面具有重要意义。鉴于目前发展的细胞糖基原位分析策略都只限于细胞表面糖基，本项目通过构建新型糖基响应性探针，发展细胞内肿瘤标志物糖基的原位分析新方法。首先构建一种具有细胞内糖基响应性的纳米探针，并引入信号放大机制，实现对细胞内糖基的原位高灵敏成像分析。其次通过设计新型线性生物大分子探针，利用超分辨全内反射荧光成像和暗场成像技术原位观察单个细胞内在糖基影响下探针组装以及分布形态的变化，并对组装分布的二维信号信息进行统计分析，结合体外标准环境下探针的二维信号变化，建立一种新的基于二维信号的非均相定量策略，应用于单个细胞内糖基的原位定量分析。本项目有望为糖基相关的生物过程的基础研究提供重要的信息，有助于深入揭示肿瘤的起因以及发展机理，并为肿瘤疾病的诊断和治疗做出积极的指导和推进。

肿瘤是当今威胁人类生命的最主要的疾病之一，对肿瘤的诊断和治疗成为时下生命科学的最重要的课题。研究发现，糖基化与细胞的恶性转化、慢性炎症状态的发展、疾病表型、肿瘤的生长、转移以及免疫有一定的相关性。发展基于肿瘤细胞糖基检测的诊断新技术，对于糖相关的生物学和医学机理研究、肿瘤的诊断和防治等方面具有重要意义。本项目成功设计了一种功能化的双色指示器探针用于细胞内糖基化过程原位成像。以细胞内氧连乙酰葡萄糖胺糖基化过程为模型，该指示器探针以聚乙酰葡萄糖胺包裹的金纳米粒子为基底，在其上组装一层荧光标记的凝集素，再利用凝集素的反向二聚结构组装上另外一层荧光标记的乙酰葡萄糖胺单糖。两种荧光发射不重叠且都能够被金纳米粒子猝灭。在细胞内游离的乙酰葡萄糖胺残基以及乙酰葡萄糖胺糖基化蛋白的存在下，组装的荧光乙酰葡萄糖胺分子和荧光凝集素会通过动态竞争结合从金纳米粒子上释放出来，进而分别点亮不同的荧光，实现细胞内乙酰葡萄糖胺糖基化蛋白和总的乙酰葡萄糖胺水平的原位同时监测。该方法被用于监测细胞内氧连乙酰葡萄糖胺糖基化过程与细胞表面分化相关蛋白的相关性，是研究糖基化平衡相关的生物过程的有力工具。此外本项目还设计了分别具有非破坏性提取和疏水选择性收集功能的浮力微球提取器和收集器探针用于细胞表面神经节苷脂的定量筛查。提取器探针是在马来酰亚胺功能化的浮力微球上修饰一段DNA探针。该DNA探针含有一个内切酶位点和苯硼酸末端用于提取细胞表面含有唾液酸的物质。将提取了目标物的提取器探针与核酸内切酶孵育后，释放的核酸-神经节苷脂可以被烷基硅烷化的收集器通过疏水相互作用选择性收集。再经过体外荧光信号放大之后，收集器上的荧光信号可以用于神经节苷脂的定量。利用唾液酸剪切酶和不同的荧光凝集素可以进一步实现神经节苷脂的亚类和再生分析，表明该方法在探究相关生物过程中的巨大应用潜力。