犬瘟热病毒变异株对水貂致病性增强的分子机制

Canine distemper virus (CDV), the causative agent of canine distemper, can infect a wide range of hosts. Hemagglutinin (H) protein plays key roles in viral virulence and host cells entry. Recently, CDV variants with 542 and 549 amino acid substitutions (isoleucine to asparagine, tyrosine to histidine) within H protein were identified from naturally infected fur animals in China. These variant isolates showed higher pathogenicity to minks as demonstrated by in vivo inoculation test. The two substitutios occurred within Signaling lymphocyte activation molecule (SLAM) receptor binding sites (RBS), of which the I542N substitution leads to a potentially novel N-glycosylation site. These findings prompt us to hypothesize that 542 and 549 amino acid substitutions may enhance the affinity between CDV-H and mink SLAM receptor. Hence, in order to characterize the relationship of these two substitutes and viral pathogenicity, we employ site-directed mutation, surface pasmon resonance (SPR) and CDV reverse genetic techniques, to determined the influence of H protein on viral proteins expression, receptor affinity and pathogenicity at in vitro and in vivo level, the results will add new inside into the pathogenesis of CDV with respect to the residues within H protein.

由犬瘟热病毒（CDV）感染引发的犬瘟热为多种动物共患传染病，CDV血凝素（H）蛋白在介导病毒毒力、受体识别等方面起到重要作用。近年来，犬瘟热在我国毛皮动物养殖地区频繁暴发。我们从犬瘟热病例中分离到CDV-H(I542N,Y549H)基因变异株，动物回归试验证实CDV变异株对水貂呈现更高致病性。542和549位氨基酸位于CDV-H蛋白的SLAM受体结合区（RBS），I542N突变使H蛋白增加了1个潜在N-连接糖基化位点。我们推测I542N和Y549H突变导致了CDV变异株对水貂的高致病性。本项目拟通过氨基酸定点突变、表面等离子共振和反向遗传操作等技术，分别在蛋白表达、细胞感染和动物致病性水平探究CDV-H蛋白542和549位氨基酸突变对病毒蛋白表达、与SLAM受体亲和力及其对水貂致病性的影响，从而阐明CDV变异株对水貂致病性增强的分子机制，为毛皮动物犬瘟热的有效防控提供理论依据。

为阐明近年来我国毛皮动物CD频繁暴发的原因，本研究对2011-2013年来自我国山东、河北、辽宁和黑龙江省16份水貂、狐狸和貉源CDV-H基因序列分析表明：与2012年之前的CDV流行株不同，10株来自山东省的CDV-H蛋白与SLAM受体的结合区（RBS）发生了I542N和Y549H突变，在系统进化树上处于Asia-1基因型独立遗传分支，我们将其命名为CDV变异株（HI542N/Y549H）。三维结构分析表明Y549H突变改变了H蛋白与水貂SLAM（mSLAM）的分子间作用力，I542N突变导致H蛋白542-544位产生了一个潜在N-连接糖基化位点。通过对CDV-H基因群体进化分析显示变异株2006年起源于我国毛皮动物，Y549H突变在H基因进化过程中受到选择压力影响。该突变株暴发可能预示着CDV在宿主或免疫压力下对毛皮动物适应性增强。. 为评价CDV变异株对毛皮动物致病性和疫苗免疫保护效果，基于我们建立的CDV动物致病模型，本研究对CDV变异株SD(14)7和经典株LN10(1)1进行动物感染试验。实验结果表明CDV变异株对毛皮动物（尤其水貂）毒力（发热、死亡率和病理变化等）和诱导免疫抑制（淋巴细胞减少症、抑制中和抗体和拮抗细胞因子表达等）水平有所增强，但当前疫苗能提供免疫动物对该变异株的攻毒保护。我们通过对2株CDV-H基因542和549位氨基酸人工突变和回复突变、CDV-H蛋白与mSLAM免疫共沉淀及细胞融合试验、氨基酸突变重组病毒株拯救及其对水貂致病性实验，在H蛋白表达、受体亲和力和细胞感染水平来探究氨基酸突变对病毒生物学特性的影响。研究结果表明：（1）I542N突变未使H蛋白在该位点被糖基化修饰，I542N和Y549H突变降低了H蛋白表达水平但增强了H蛋白与mSLAM相互作用。（2）I542N和Y549H突变增强了CDV-H/F蛋白对表达mSLAM细胞的融合能力。（3）Y549H突变增强了重组CDV病毒对水貂的致死率。综上研究表明，近年来我国毛皮动物CD频繁暴发可能是由于强毒力CDV变异株的出现，揭示了CDV变异株对毛皮动物（尤其水貂）致病性增强的分子机制。