最小杆状病毒的人工合成

Baculoviruses are insect specific viruses which have been widely used as biological control agents against pests, as well as vectors for gene expression and gene delivery. It is known that a large part of baculovirus genome contains ORFs that are non-essential for cellular infection. Those accessory genes facilitate virus’ infection in insect hosts and transmission between insects. Therefore, the baculovirus genome can be minimalized to get better vectors for gene expression and gene delivery. Recently, we reported the construction and rescue of a functional synthetic AcMNPV with 145 kb genome. It provides a platform for constructing of a minimal baculovirus. In this project, we plan to : 1) reveal all the essential genes of AcMNPV by constructing single gene deletions and infection analyses; 2) divide the AcMNPV genome into several segments, minimalize each segment by construction of deletion mutants and infection analyses; 3) construct minimal genomes of AcMNPV via bottom-up and top-down strategies. Conduct infection assay, and fix the infectivity via several rounds of redesign and functional analysis. Our goal is to obtain a minimal AcMNPV with sufficient cellular infectivity. This study will provide a better backbone to develop baculovirus vectors with larger capacity and better properties for gene expression and gene delivery. It will also provide new insights into the fundamental research of baculovirus.

杆状病毒是昆虫特异性的大DNA病毒，在生物防治、外源基因表达、基因传递等方面发挥着重要的作用。研究表明，杆状病毒基因组中有相当一部分是细胞水平感染的非必需基因，它们的功能是帮助病毒更好地在虫体水平上感染与传播。因此，作为基因的表达和传递载体，杆状病毒的基因组具有很大的可塑空间。我们最近成功地合成了杆状病毒的模式病毒AcMNPV，为开展最小杆状病毒的研究提供了平台。本项目中，我们拟通过：1）系统构建单基因缺失的重组病毒及其活性研究,全面揭示AcMNPV的必需基因；2）分段最小化，开展AcMNPV基因组的可塑性研究；3）利用人工合成技术平台，采用bottom up 和top down的两种策略，构建出最小化基因组，最终拯救出在细胞水平保持高感染能力的最小AcMNPV。本研究预期可为外源基因表达和传递提供容量更大、性能更好的载体平台，也将为杆状病毒基础研究提供全新的视角，具有重要的研究价值。

杆状病毒是昆虫特异性的大DNA病毒，在生物防治、外源基因表达、基因传递等方面发挥着重要的作用。杆状病毒基因组中有相当一部分是细胞水平感染的非必需基因，它们的功能是帮助病毒更好地在虫体水平上感染与传播。因此，作为基因的表达和传递载体，杆状病毒的基因组具有很大的可塑空间。本项目的研究目标是全面揭示杆状病毒基因组上细胞水平复制的必需基因，在此基础上开展AcMNPV基因组的缩减及人工合成。. 通过本项目研究，我们取得了如下成果：1）全面揭示了AcMNPV的必需基因：通过构建所有AcMNPV未知基因单独缺失的bacmid, 并转染、感染以及生长曲线分析，全面阐释了前期未知的42个基因的功能，结合已发表的文献，最终揭示AcMNPV的155个基因中有46个必需基因、10个对病毒复制有重要影响的基因，以及99个非必需基因。这是首次系统阐释AcMNPV基因的功能，研究成果发表在Virologica Sinica上（Chen et al., 2021）,本项目第一标注。2）在杆状病毒基因组同源重复区多位点编辑中取得重要突破：同源重复区hrs在病毒的生命周期中发挥着关键作用，也是病毒基因组编辑的难点。我们利用杆状病毒人工合成平台，对AcMNPV的基因组进行了多位点同时删除，并成功地进行了病毒拯救。研究结果表明，hrs的全部缺失将无法获得子代病毒，但仅保留hr2或hr3即可获得较高复制能力的子代病毒，此外，还揭示了hr对邻近区域基因转录的增强效果，为杆状病毒表达载体的优化提供了新思路，研究结果发表在ACS Synthetic Biology上（Hu et al., 2022）, 本项目第一标注。3）利用人工合成技术获得了基因组缩减~17 kb的AcMNPV-Syn-mC1-1.1：我们利用人工合成平台，通过design-build-test循环进行检测和修订，最终获得了基因组缩减~17 kb的AcMNPV-Syn-mC1-1.1。对比其亲本病毒，该病毒缺失了20个非必需基因，研究结果发表在Viruses上（Guo et al., 2022）,本项目第一标注。. 综上所述，本项目全面超额完成了任务目标，截止项目结题时，共发表项目标注SCI论文5篇。