p66shc调控特发性肺纤维化形成的表观遗传机制研究

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is closely correlated with oxidative stress. P66shc plays a pivotal role in oxidative stress of mitochondrion. It's role in IPF remains unknown. Our preliminary work found that the expression of p66shc was elevated in fibroblast of patients with IPF,TGF-β1 and epigenetic modification can modulate the expression of p66shc.It has been demonstrated that p53 can transcriptionally regulate the expression of p66shc and TGF-β1/Smad p53 palys a role in fibrosis disease.So we hypothesize that TGF-β1/Smad p53 may regulae the expression of p66shc through epigenetic mechanism and participate in the pathogenesis of pulmnary fibrosis.The aims of this research are,using lung biopsies of clinical patients, cultured fibroblast and animal models, evaluating the role of p66shc in IPF, investigating if TGF-β/Smad p53 signal pathway can upregulate p66shc expression through DNA promotor demethylation and histone acetylation, provoke oxidative stress and the differentiation of lung fibroblast, eventually result in the formation of pulmonary fibrosis. The completion of this study could provide a new avenue for the treatment of IPF.

特发性肺纤维化（IPF）与氧化应激密切相关。P66shc在促进线粒体氧化应激产生中起关键作用，其在IPF中的作用尚无研究。我们前期工作表明IPF患者p66shc表达增高，TGF-β1和表观遗传修饰可调节p66shc的表达。TGF-β1/Smad p53参与纤维化病变的形成,p66shc为p53下游效应基因。推测TGF-β1/Smad p53可能通过对p66shc的表观遗传修饰，参与肺纤维化的发病机制。本课题拟利用活检标本、体外培养肺成纤维细胞和动物模型，进一步了解p66shc在IPF中的表达，及TGF-β1/Smad p53信号通路，是否转录调控p66shc DNA启动子区域的去甲基化和组蛋白乙酰化修饰，上调p66shc的表达，产生氧化应激，促进成纤维细胞的分化和肺纤维化的形成，从而揭示p66shc在IPF形成中的作用和机制。为IPF防治开辟新途径。

特发性肺纤维化(IPF)是一种严重肺间质病变, 致残率、病死率高。 确切的发病机制尚未完全阐明，目前无确切有效的治疗方法。已有实验证实凋亡抵抗和组蛋白乙酰化调节在肺纤维化的形成中起重要的作用。组蛋白乙酰化酶抑制剂可促进细胞凋亡，p66shc介导细胞凋亡，组蛋白乙酰化修饰可调节p66shc的表达。因此本实验的主要目的为研究p66shc在肺纤维化形成中的作用和机制以及组蛋白乙酰化对其作用的影响。我们的实验证实，在TGF-beta1 诱导的成纤维细胞分化中，TGF-beta1浓度依赖性地降低p66shc的表达，增加a-SMA、磷酸化Smad2/3的表达；siRNA沉默p66shc后，a-SMA、磷酸化Smad2/3的表达降低，提示p66shc参与成纤维细胞的分化。组蛋白乙酰化酶抑制剂SAHA、TSA剂量依赖性地增加TGF-beta 诱导下的p66shc的表达，降低a-SMA、磷酸化Smad2/3的表达，增加凋亡指标Cleaved-Caspase 3的表达，增加组蛋白 H3AC、H3K4Me3、H4K5AC、H4K8AC、H3K18AC的表达；沉默p66shc可进一步增加SAHA、TSA的上述作用，增加Cleaved-Caspase 3的表达。用流式细胞计数仪测定细胞凋亡，可见SAHA明显增加细胞凋亡，沉默p66shc后细胞凋亡进一步增加。已成功建立博来霉素肺纤维化动物模型，并用SAHA干预，H&E染色证实博来霉素明显增加肺纤维化，SAHA降低博来霉素诱导的肺纤维化。免疫组化证实博来霉素增加肺组织a-SMA的表达，SAHA降低博来霉素导致的a-SMA的表达，p66shc的结果待染色。本实验结果提示，p66shc在肺成纤维细胞的分化中起重要作用，p66shc通过调节细胞凋亡介导组蛋白乙酰化酶抑制剂对成纤维细胞分化的抑制。此实验的研究结果可为IPF的防治提供新的靶点。.我们同时研究Sirtuin2在肺纤维化形成中的作用，目前实验数据证实TGF-β1促进人胚肺成纤维细胞SIRT2表达，抑制SIRT2表达降低TGF-β1诱导的人胚肺成纤维细胞分化，SIRT2可能通过SIRT2/AKT/mTOR信号通路调节TGF-β1诱导的肺成纤维细胞的分化，参与肺纤维化的形成。