p53阻遏牛体细胞克隆胚胎重编程的机制研究

p53在细胞的生长、分化、应激等生命过程中起着重要的调控作用。前期的研究发现在牛体细胞克隆胚胎重编程过程中，p53表达上调与基因组高甲基化水平有关。本项目拟进一步用含有靶向p53基因干扰载体pSliencer 2.1-148p53或pSliencer2.1-228p53的牛胎儿成纤维细胞为核供体进行核移植，获得不同p53 mRNA水平的胚胎，采用实时RT-PCR和Western blot技术检测干扰效率，用免疫荧光技术进行甲基化和乙酰化分析，确定p53 mRNA水平异常与胚胎重编程之间的关系；采用亚硫酸盐测序和ChIP技术，分析p53基因CpG岛甲基化状态和组蛋白对p53基因的调控作用，明确克隆胚胎重编程过程中p53异常表达的表观遗传学机制。本项目有助于阐明体细胞克隆胚胎重编程的分子机制，为提高体细胞克隆效率，将体细胞克隆技术应用于家畜改良、珍稀动物保护等领域奠定基础。

前期研究发现转录因子p53的转录活性在牛体细胞克隆胚胎发育早期异常升高,并且伴随着异常的重编程过程。通过本项目进一步研究发现(1)牛体细胞克隆胚胎早期发育过程中p53表达水平异常升高与其启动子区两个CpG岛的低甲基化修饰有关；(2)基因表达芯片分析发现，与受精胚胎相比p53下调58%后克隆胚胎内基因表达差异大于2的基因仅有0.93%，而未经处理的克隆胚胎内达到36.87%；(3) 进一步采用定量分析技术发现与表观修饰重要相关的基因中，去乙酰化酶1（HDAC1）和甲基化酶3a(DNMT3a)基因的表达变化与胚胎的甲基化和乙酰化修饰水平变化一致，说明高水平p53阻碍牛体细胞克隆胚胎重编程的原因是上调了去乙酰化酶1（HDAC1）和甲基化酶3a(DNMT3a)基因的表达，导致发育重要基因的甲基化水平升高，而乙酰化水平下降，从而抑制了一些发育重要基因的正常表达；(4)采用免疫共沉淀技术进一步发现HDAC1基因是转录因子p53下游一个直接的靶基因，在牛体细胞克隆胚胎早期发育过程中，p53通过直接作用HDAC1而间接作用DNMT3a基因调控重编程；(5)将p53基因的表达下调到42%左右可以改善重编程，提高胚胎发育到囊胚阶段的比率，但是如果下调77%以上，会导致胚胎发育速度降低，线粒体功能异常；(6)基于p53对线粒体代谢和胚胎发育的重要影响，以及Mfn1对线粒体功能的重要调控作用，我们进一步采用采用生物信息学方法，发现Mfn1启动子处有一个经典的p53蛋白结合位点，将预测的Mfn1基因启动子区域p53蛋白结合位点进行生物素标记，采用凝胶电泳阻滞实验发现Mfn1是p53下游一个新的靶基因，p53通过调控Mfn1基因从而介导线粒体代谢和胚胎发育。该研究对揭示能量产生的遗传规律，阐明克隆胚胎的发育机理，提高体细胞克隆效率具有重要意义；为加快优良种畜的扩繁，挽救珍稀濒危动物奠定基础。