miR-223调控脓毒症CD4+T淋巴细胞自噬及相关免疫功能研究

Immune imbalance plays a vital role in the process of sepsis, and cells autophagy disturbance induces cells death is one of the main mechanisms of immune imbalance. Our previous studies have found that serum miR-223 can predict the prognosis of sepsis patients. In the experimental study, miR-223 can regulate proliferation, differentiation and apoptosis of CD4+T cells in sepsis, and miR-223 induces CD4+ T cells death via regulating cells autophagy. In the study, we focus on the following problems: 1. To clarify the effects of miR-223 and CD4+T cells autophagy on immune function and prognosis for sepsis patients; 2. To find the targets of miR-223 regulating CD4+T cells autophagy and investigate the mechanism; 3.To validate the roles of miR-223 on regulating autophagy of CD4+T cells in knock-out septic animal models, and confirm the effect of miR-223 intervention on the prognosis of septic animal models. So that to provide experimental and theoretical evidences for the immunomodulatory treatment of sepsis.

免疫失衡在脓毒症发生发展中起着关键作用，细胞自噬活性异常导致免疫细胞死亡是免疫失衡的主要机制之一。我们前期筛选出循环miR-223能够早期预警脓毒症患者预后，发现miR-223参与脓毒症患者CD4+T淋巴细胞增殖、分化和凋亡的过程，并可通过调控细胞自噬而促进CD4+T淋巴细胞死亡。本研究在前期工作基础上拟解决以下问题：1、明确miR-223与CD4+T淋巴细胞自噬对脓毒症患者免疫失衡和预后的影响；2、明确miR-223调控CD4+T淋巴细胞自噬的作用靶点和作用机制；3、在敲基因脓毒症动物模型上验证miR-223对实验动物免疫失衡的影响，并通过miR-223干预明确其对动物模型预后的作用。为寻找脓毒症免疫调节治疗的潜在新靶点提供实验和理论依据。

脓毒症是指由感染引起的全身性炎症反应综合征（SIRS），是指器官功能障碍的严重感染。免疫失衡在脓毒症的发生和发展中起关键作用。免疫抑制是脓毒症患者高死亡率的主要原因。T淋巴细胞功能障碍是脓毒症免疫功能障碍中最重要的部分，CD4 + T淋巴细胞数量和功能障碍的减少在脓毒症的免疫抑制状态中起着关键作用，进而影响败血症的发生和预后。随着脓毒症研究的进展，自噬已被证明在脓毒症过程中免疫失衡和T淋巴细胞的免疫功能中起着重要的作用。在我们以前的工作中，我们证明了脓毒症患者血清中循环miR-223的阳性临床价值及其作为脓毒症的早期生物标志物的功能。在这项研究中，我们通过化学合成物（带有GDP标签）转染Jurkat T 淋巴细胞系使miR-223的表达量增高或降低。用流式细胞术和荧光显微镜评估转染效率，并用qPCR评估miR-223的表达。使用双标记慢病毒（mRFP-GFP-LC3）和电子显微镜监测自噬水平，并用Western blot分析在miR-223表达量不同的细胞中，LPS处理后自噬相关蛋白（LC3B， P62）和FOXO1的水平；随后使用siRNA降低FOXO1的表达后，对miR-223不同表达的Jurkat T细胞探究其自噬水平。使用敲基因miR-223小鼠（20只），C57BL/6J小鼠（120只）作为对照小鼠，给予腹腔注射NS及大肠杆菌悬液，对干预后小鼠的重量变化、生存率进行了追踪与统计，并对小鼠健康情况进行疾病评分，对小鼠多脏器进行脏器指数统计分析，病理学方法观察小鼠肺组织HE染色与炎症评分，小鼠常规方法进行支气管肺泡灌洗液细胞计数，流式细胞术检测循环血、肺泡灌洗液及脾脏CD4+T淋巴细胞及细胞自噬水平。我们发现，当miR-223的表达增加时，FOXO1的表达减少而自噬增加。而当FOXO1表达受到抑制时，LPS诱导后不同细胞模型中的自噬明显降低。病理学染色显示敲基因鼠较野生型小鼠在接受LPS腹腔注射干预后，脏器受损更加严重，流式细胞术分析在敲基因鼠中CD4+T淋巴细胞的自噬水平明显下降，与小鼠生存曲线成反比。因此，miR-223可能通过调节FOXO1参与LPS诱导的自噬的调节。miR-223可以在一定程度上通过FOXO1上调脓毒症小鼠CD4+T淋巴细胞自噬水平，提示miR-223有可能作为脓毒症预防和治疗的潜在靶点。