氢离子感受器GPR4在卵巢癌血管生成中的作用及机制探讨

卵巢癌死亡率高，疗效差。血管新生对肿瘤发展必不可少，若能消除血管新生则可阻止肿瘤发展。血管新生常发生在组织缺氧时，缺氧时H+↑是启动血管新生的重要因素。H+感受器可能与血管新生关系密切。我们首次发现磷脂受体GPR4对生理性血管新生异常关键，敲除GPR4后内皮细胞难以形成血管，但机制不清楚。近年来还发现GPR4是个H+感受器。另外肿瘤内H+常↑，我们推测GPR4也参与了肿瘤的血管生成，且促血管生成作用由其H+感受器功能所介导。本项目以卵巢癌为例，研究①GPR4是否参与了卵巢癌的血管生成；②敲除GPR4后能否抑制卵巢癌血管生成；③GPR4促卵巢癌血管生成作用是否由其H+感受器功能所介导。第一次将H+感受器与血管新生联系起来，目前尚无此方面报道。通过探索抑制H+感受器功能能否抑制肿瘤血管新生，为阻止肿瘤血管生成提供新思路和作用靶，对阻止肿瘤生长和血行转移有重要意义，并深入明确肿瘤的血管生成机制。

主要研究发现：.（一）.GPR4通过氢离子感受器功能调节内皮细胞的血管生成.在血管内皮细胞中GPR4可能通过氢离子感受器作用参与调节血管的生成。pH改变时细胞合成的cAMP显著变化，cAMP又介导了VEGF变化。VEGF是最强的血管生成促进因子，因此GPR4可能通过氢离子感受器功能参与促进血管生成的。.（二）基因芯片检测内皮细胞敲除GPR4基因后的基因组变化.成功构建了稳定敲除 GPR4的内皮细胞，cDNA芯片检测基因表达谱变化， 明显差异表达的基因有447个，其中129个基因在GPR4敲除细胞中上调,318个基因下调。这些基因涉及细胞调亡、细胞骨架及信号传导、细胞增殖、分化及周期调控等方面。.（三）. Notch参与了GPR4对血管内皮细胞血管生成的调节.在血管内皮细胞HMEC-1中，转染GPR4后Notch1的表达上调，内皮细胞形成血管状结构增多、淋巴细胞跨内皮的迁移增多、内皮细胞产生的VEGF和 HIF-1α增多，再同时转染入Notch1的siRNA或应用Notch 受体的抑制剂GSI-I后, GPR4介导的血管状结构生成、淋巴细胞跨内皮迁移、VEGF和 HIF-1α产生都显著受到抑制；.（四）. GPR4参与了卵巢癌血管的生成.1. 卵巢癌中GPR4的表达水平远高于良性卵巢肿瘤， GPR4的表达水平与微血管密度呈正相关，说明GPR4参与了卵巢癌中血管的生成。.2. 上皮性卵巢癌中GPR4的表达强度与肿瘤病理分级、组织学类型、是否有腹水无关，与淋巴结转移，临床分期有关。.（五）. Wnt/TCF7 参与了GPR4对卵巢癌细胞功能的调节，包括克隆形成率、侵袭、凋亡:.1. 在高表达GPR4的血管内皮细胞HMEC-1细胞中发现，Wnt通路的所有成员都表达，提示Wnt通路可能与GPR4的作用有关。.2. 比较了4种卵巢癌细胞系，发现卵巢癌细胞A2780的内源性GPR4表达水平最高，在A2780中敲除GPR4的表达后细胞在软琼脂上的克隆形成率降低、细胞侵袭性显著降低、细胞发生凋亡、MMP2和MMP9表达水平下降。.3. A2780中应用TCF7的siRNA敲除TCF7后，A2780细胞A2780细胞在软琼脂上的克隆形成率降低、细胞侵袭性显著降低、细胞发生凋亡、MMP2和MMP9表达水平下降。