橡胶树原生质体遗传转化体系的建立及HbCS4基因的导入

It is the most important task of natural rubber industry to improve the current cultivar and enhance the yield of the unit area in our country. Genetic transformation is a key biotechnology technique for rubber tree improvement. The existing rubber tree genetic transformation system which used callus or embryoid as the receptor for donor gene has disadvantages of low transformation efficiency, pollution of the Agrobacterium and easy production of chimera, resulting in restricting the development of genetic breeding in rubber tree. Using protoplast as the transformation receptor can effectively overcome the problems mentioned above, for it has a huge quantity in a small volume, no need to use Agrobacterium, and the regenerated plant belongs to the single cell origin. We have established plant regeneration system from protoplast of rubber tree, and cloned a citrate synthase gene form rubber tree, named HbCS4, which is closely related to the resistance and latex yield. This project will use PEG-mediated method to establish protoplast transformation system, and then transfer the fusion expression vector HbCS4: GFP into protoplast of rubber tree through this transformation system for subcellular localization studies. Cell lines and regenerated plants over-expressing the HbCS4 gene would be obtained by protoplast culture. The successful implementation of this project would provide theoretical basis and practical guidance for subcellular localization studies of other functional proteins and protoplast transgenic breeding model in rubber tree.

改良橡胶树现有栽培品种提高其单位面积产量，是我国天然橡胶产业面临的首要任务和亟需解决的重大课题，基因转化是进行橡胶树种质改良的重要生物技术手段。现有橡胶树遗传转化体系以愈伤组织或胚状体为受体，存在转化效率低、农杆菌污染、易产生嵌合体等不足，限制了橡胶树转基因育种的发展。以原生质体为转化受体，体积小、数量庞大，无需使用农杆菌，且经其发育的植株属于单细胞起源，可有效克服上述问题。我们已建立橡胶树原生质体植株再生体系，并克隆了与抗逆和胶乳产量密切相关的橡胶树柠檬酸合酶基因（HbCS4）。本项目拟采用PEG诱导法建立橡胶树原生质体遗传转化体系，利用该体系将融合表达载体HbCS4：GFP导入橡胶树原生质体中，进行亚细胞定位研究，并通过原生质体培养技术获得过表达HbCS4基因的细胞系及再生植株。本项目的成功实施将为橡胶树其它功能蛋白的亚细胞定位研究及橡胶树原生质体转基因育种模式提供理论依据和实践指导。

我国天然橡胶供需缺口逐年加大，改良橡胶树现有栽培品种，提高其单位面积产量，是我国天然橡胶产业面临的首要任务和亟需解决的重大课题。基因工程是进行橡胶树种质改良的重要生物技术手段。然而现有的橡胶树遗传转化体系存在转化效率低、易产生嵌合体等问题，限制了橡胶树转基因育种的发展。本项目建立了高效的PEG介导橡胶树原生质体遗传转化体系，通过该体系对与橡胶树产量和抗性密切相关的柠檬酸合酶基因（HbCS4）进行瞬时表达及亚细胞定位研究，并采用基因枪法将该基因导入橡胶树中进行稳定表达；同时利用优化的橡胶树原生质体转化体系进行CRISPR/Cas9介导的橡胶树基因编辑及无外源质粒载体的RNP基因编辑研究。本项目的研究结果可为橡胶树其它功能基因的瞬时表达和亚细胞定位研究提供快速高效的转化体系，并为进行橡胶树开花相关基因编辑研究提供有效的靶点，加快了采用基因编辑技术进行橡胶树遗传改良的进程。本项目主要研究内容和重要结果如下：.（1）对橡胶树愈伤组织、悬浮细胞、叶片等不同材料来源的原生质体进行PEG介导的原生质体转化研究，同时比较了不同质粒使用量、PEG浓度及PEG处理时间对转化效率的影响。结果表明，以橡胶树黄化苗叶片来源的原生质体在质粒量为50 μg、PEG浓度为40%、PEG处理时间为15 min，原生质体的转化效率最高，可达60%左右。.（2）通过上述优化的原生质体转化体系将柠檬酸合酶基因（HbCS4）成功转入橡胶树原生质体中，在荧光显微镜下可观察到该基因在细胞质中呈点状或线状表达。.（3）以具有高体胚发生能力的橡胶树易碎胚性愈伤组织为材料，采用基因枪法将HbCS4:GFP融合表达载体导入橡胶树中，通过后续培养和荧光筛选获得了5个阳性胚，但未能进一步发育成正常植株。.（4）利用已建立的橡胶树叶片原生质体转化体系对橡胶树开花相关基因（TFL）进行CRISPR/Cas9介导的橡胶树基因编辑及无外源质粒载体的RNP基因编辑研究，均成功检测到编辑突变。.