基于功能基因组学解析大黄功效组分型形成基因机制的研究

如何保证优质稳定中药材的可持续供应，一直是中医药领域倍受关注的焦点。对于多功效中药材来说，"功效组分型"分化是导致药材质量不稳定的重要因素，研究中药材"功效组分型"分化及其形成的基因机制，对于"定向选育"特种功效专用药材品种。实现特种功效专用药材的人工培育，帮助中医实现"更为精确的对症用药"，确保中药疗效的稳定性，均具有重要的理论和实践指导意义。.本项目拟以大黄作为多功效药材的代表种，在系统解析其3种功效组分（泻下、抑菌和抗凝血组分）构成的基础上，划分大黄功效组分型，并综合运用cDNA-SRAP标记和RACE扩增技术，从功能基因组水平，筛选与大黄功效组分型形成相关的关键功能基因，进而根据不同功效组分型关键功能基因的表达量差异，从组合效应角度，深入解析功效组分型形成的基因机制。为特种功效专用大黄品种的定向选育，为优质大黄的分子育种，也为其他多功效药材开展类似研究奠定理论和技术基础。

本研究以不同产地和基原大黄以及同一地块不同变异类型大黄为材料，基于高效液相色谱法（HPLC）、分子条形码技术、cDNA-SRAP技术和基因同源克隆及RT-PCR技术，对大黄功效组分含量变异分化，特别是功效组分型分化及其形成的基因机制进行了研究。结果表明：（1）唐古特大黄和掌叶大黄均存在丰富的种内变异，大黄3个基原植物中以唐古特大黄药材质量最佳，应作为今后主要栽培的品种；同时发现，现有对大黄属鉴别条形码研究报道中，对物种鉴别有误，部分掌叶大黄应为唐古特大黄；（2）唐古特大黄存在丰富的种内变异类型，基于这些变异类型可筛选出清热解毒型、活血化瘀型和攻积泻下型3类功效组分型，大黄植株的叶柄和茎部红色斑点和功效组分含量存在显著的相关关系；（3）唐古特大黄根和根茎功效组分含量存在差异，表现为根部功效组分含量高于根茎；（4）不同功效组分型的cDNA-SRAP分析共获得5条差异表达基因片段和4条表达量有明显差异的公共条带，其中4条功能已知，分别与植物生长发育及光信号转导、植物抗病性及水分运输相关，5条功能未知。分析中为发现与功效组分代谢密切相关的基因；（5）直接基于各类成分的生合成途径，首次克隆得到了唐古特大黄的查尔酮合酶基因（CHS）、芦荟松合酶基因（ALS）和无色花青素还原酶基因（LAR）三个关键功能基因核心片段，并对40个大黄变异类型的关键功能基因表达量进行分析发现，功效组分含量与各基因表达量也未呈现显著的相关关系（P>0.05）。以上结果证实，大黄药材存在显著的功效组分含量差异，导致其差异的来源包括基原、产地、药用部位，也包括种内变异，对唐古特大黄研究发现申请者提出的“功效组分型”分化确实存在，然而，采用cDNA-SRAP未能找到功效组分含量差异的分子证据，这主要与功能基因存在时空表达有关。进一步采用40个个体的大样本，并基于关键功能基因表达量分析，也未能获得功效组分含量与基因表达量的显著相关，导致这一现象的原因主要与功效组分的形成与积累受基因网络调控，基于个别基因无法全面揭示合成产物含量的差异有关。本研究暗示，大黄可通过选育优良品种，配合选择特殊产地、选取特定的药用部位来定向培育特种用途优质药材，这对于优质大黄药材培育具有重要的指导意义。申请者后续将对大黄特种用途品种筛选进行研究，同时将进一步改善方法，深入开展和相关基因机制研究。