基于免疫原特异分析技术的中药注射剂速发型变态反应致敏组分筛选体系构建

中药注射剂为我国传统中药的现代新剂型，但不良反应的频繁发生严重阻碍了中药注射剂的发展。Ⅰ型变态反应是中药注射剂最严重和常见的不良反应，对导致中药注射剂Ⅰ型变态反应发生的物质基础缺乏准确高效的研究手段是这类问题难以解决的关键。现有中药注射剂Ⅰ型变态反应研究多限于临床案例的综合评价及对已知致敏原的分析，对于未知致敏原的分析和致敏性的预测缺乏有力研究方法。本项目旨在建立系统全面的Ⅰ型变态反应致敏物质共性分析技术，用于探索中药注射剂的致敏物质基础和预测中药致敏性。研究首先在Ⅰ型变态反应发生抗原抗体结合的基础上，建立新型中药注射剂Ⅰ型变态反应致敏原分离技术；继而对致敏原组分进行细胞分子水平和整体动物的致敏性验证；最后鉴别明确致敏原组分。本项目建立新型Ⅰ型变态反应中药注射剂致敏原组分研究技术体系，为中药注射剂安全性评价与再评价提供关键技术支撑，也为其它中药制剂及其它类型致敏性成分的研究提供示范。

本项目依据中药注射剂Ⅰ型变态反应发生的免疫学本质，建立新型的中药注射剂免疫原特异性分离技术；研究中药致敏原组分，从细胞分子水平和整体动物水平进行致敏性验证。研究完成内容主要包括：1、I型变态反应的敏感动物筛选及药物致敏性考察：（1）I型变态反应的敏感动物筛选实验结果表明：SD大鼠、豚鼠、BN大鼠血浆中的反映I型变态反应发生的敏感指标均明显升高；BN大鼠、豚鼠的被动皮肤过敏反应的蓝斑发生率高于SD大鼠。表明BN大鼠与豚鼠对变态反应的敏感性高于SD大鼠，考虑到实验成本，故I型变态反应的研究宜选用豚鼠。（2）药物致敏性考察：选用临床易引起I型变态反应的中药注射剂进行药物致敏性考察，结果清开灵注射液等组主动过敏实验豚鼠血浆中反映I型变态反应发生的敏感指标IgE、组胺、β-氨基己糖苷酶含量在激发前后显著升高。被动皮肤过敏实验显示清开灵注射液等组大鼠背部皮肤出现蓝斑。主动全身过敏和被动皮肤过敏实验结果相互验证表明这些注射液存在致敏性。2、建立用于被动过敏反应实验的综合评判方法：被动皮肤过敏反应实验是Ⅰ型变态反应性疾病的常用实验方法，传统的被动皮肤过敏反应主要观察指标为根据局部皮肤蓝染范围来判定血管通透性变化，继而判定变态反应的程度。但该指标精确度较差，且假阴性率较高。本部分实验确立一种通过综合考察动物的一般症状、血液学指标、全身各部位的变化情况、脏器的组织病理学改变等多个指标来判断变态反应发生与否。3、建立新型的中药注射剂诱发Ⅰ型变态反应致敏成分分离方法：用绿原酸、穿琥宁注射液等成分明确的药品，利用酶联免疫的原理，采用抗原抗体分离的方法，分离其各自的成分，且采用液质检测分离出的成分确为绿原酸、穿琥宁注射液等药物的主要成分。整体动物实验也表明这几种药物有一定的致敏性。4、体外细胞生物学研究I型变态反应：I型变态反应的发生与肥大或嗜碱细胞脱颗粒相关，实验采用大鼠嗜碱性白血病细胞株RBL-2H3，观察前期研究确定的致敏组分制备抗血清的细胞培养上清组胺、β-氨基己糖苷酶含量等。结果表明：卵蛋白、绿原酸、穿琥宁注射液能够引起RBL-2H3释放的变态反应的敏感指标组胺、β-氨基己糖苷酶明显改变，而这一结果与整体动物实验中卵蛋白溶液、绿原酸、穿琥宁注射液的变态反应实验结果一致，表明体外细胞实验可以作为验证致敏原的一种有效的方法。