群体感应信号顺式-2-十二碳烯酸新型感受器调控洋葱伯克霍尔德菌耐药和毒力作用机制研究

Traditional antibiotics have been used as a primary method to treat infection. Considering the function of antibiotics is either to kill microorganisms or to inhibit the growth of the bacteria, however, antibiotics resistance will persist permanently. Early discovery that widely distributed cis-2-dodecenoic acid (BDSF) quorum sensing system regulated bacterial biological function and virulence, luckily, provided us a hint to solve this tough problem by blocking the effective conjugation of signaling molecules and receptors which resulted in pathogen failure. Therefore, in this project, we plan to use Burkholderia cenocepacia, which is an antibiotic-resistant bacterium and an opportunistic pathogen in cystic fibrosis, to investigate the effect of BDSF new receptor on the antibiotic resistance and virulence of this bacterium. By analyzing and identifying the BDSF new receptor and regulator, illustrating the interaction between this receptor and regulator and its regulation mechanism of target genes to determine the molecular mechanisms of this receptor on bacterial antibiotic resistance and virulence. Furthermore, the effect of different environmental factors on the expression of receptor will also be studied to explore the transmission mechanism of pathogen in the environment. The outcome of this project will absolutely promote us to take insights into the molecular mechanisms of BDSF quorum sensing signaling communication network on bacterial resistance and virulence, and lay a foundation to develop new strategy for disease prevention and control.

传统的抗生素以直接杀死微生物或抑制微生物生长抗感染，因此无法解决耐药性的问题。鉴于顺式-2-十二碳烯酸(BDSF)群体感应系统广泛存在于病原菌中并调控其抗性和毒力等重要功能，以细菌群体感应为靶标，通过阻碍信号分子与受体蛋白的有效结合来诱导病原菌衰竭达到治疗感染的目的，为彻底解决耐药性问题提供了一种可能。本项目拟以引起囊性肺纤维化且对大多数抗生素具有耐药性的新洋葱伯克霍尔德菌为研究对象，通过分析鉴定BDSF信号新型感受器蛋白和调控子蛋白，考察与受体蛋白相互作用的调控子蛋白调控目标基因的方式，确定感受器在细菌的抗性和毒力基因调节过程中的作用机理；并通过调节环境因子研究致病菌受体蛋白的表达情况，揭示致病菌在环境中传播规律。该项目的完成有助于拓宽人们对人体/植物重要病原菌的耐药和毒力机理了解，并为以BDSF信号系统为靶标来创造可普遍使用、无耐药性的病原菌防治方法打下良好的基础。

临床上有80%的感染是由可导致囊性肺纤维化且对大多数抗生素具有耐药性的新洋葱伯克霍尔德菌引起的，因此，以细菌群体效应为靶标研究群体感应信号受体蛋白对新洋葱伯克霍尔德菌的环境行为和耐药机制，可给临床治疗提供依据。BDSF通过受体蛋白 RpfR 负调控胞内 cidi-GMP 浓度水平，影响多种与生物被膜形成和毒性相关的基因表达。本研究通过构建Tn5突变体库，筛选出一个含有 PAS-GGDEF-EAL结构域，类似BDSF的受体蛋白，将其命名为RpfR2。利用基因敲除和过表达技术构建RpfR2基因缺失的突变菌株和回复突变菌株，发现RpfR2可调控群集运动，生物膜形成等表型。细胞和动物染毒实验也表明，RpfR2影响c-di-GMP调控的毒力。RpfR2与c-di-GMP代谢之间的关系研究发现， RpfR2突变体胞内c-di-GMP 的浓度比野生型高两倍，而回复突变菌株中的浓度恢复到了野生型水平，揭示RpfR2可降解c-di-GMP。RpfR2蛋白与c-di-GMP体外酶活研究也表明RpfR2可降解 c-di-GMP，生成pGpG。RpfR2可以在体外结合c-di-GMP，但是不能结合BDSF，表明RpfR2可以通过直接结合方式降解c-di-GMP。将c-di-GMP 降解酶RocR过表达到RpfR2 突变体中，发现其可以大幅度恢复RpfR2突变体的表型，进一步将三个结构域基因过表达到RpfR2突变体中，发现只有RpfR2EAL能恢复 RpfR2突变体表型，揭示RpfR2降解c-di-GMP是EAL结构域发挥作用。RNA-Seq分析发现RpfR2突变体中共有126 个基因表达上调，137 个基因表达下调，这些基因主要调控毒力因子产生，压力胁迫，膜组分，细胞粘附等功能。. 细菌的群体感应同时也能诱导毒理因子的产生，进而影响耐药和毒理作用。为了揭示致病菌在环境中传播规律，通过实验室模拟和外场验证，发现环境因子如COD等与ARGs呈现显著相关性，此外，群体感应和毒理因子也和耐药基因具有显著的相关性，揭示群体感应能通过促进信号分子合成和降解基因的表达来促进细菌的交流，进而影响ARGs的表达。我们的研究成果有助于深入了解病原菌的耐药和毒力机理，并为以群体感应系统为靶标来创造可普遍使用、无耐药性的病原菌防治方法打下良好的基础。