花生LTR反转录转座子的分子标记开发利用研究

Cultivated peanut had a narrow genetic basis, and limited molecular markers. However LTR retrotransposons had been proved to be very suitable for developing molecular markers, owning to the characteristic of high copy, highly heterogeneous and insertion polymorphisms. Further the activation of peanut LTR retrotransposons had correlation with the rich variation of morphological, physiological, and agronomic traits. So in this project, with the available RT sequences of peanut LTR retrotransposons amplified by PCR, adaptor-mediated semi-nested degenerative PCR, iPBS technology and genome walking based on adaptor-mediated nested PCR were utilized to isolate the RNaseH-LTR, PBS-LTR and complete sequences of LTR retrotransposons respectively. And then the S-SAP, IRAP and REMAP molecular marker techniques were developed and used to explore the genetic diversity of cultivated peanut. The major objectives of this project were: (1) to develop novel molecular marker technology in cultivated peanut and introduce more molecular markers into cultivated peanut; and (2) to make up for the serious shortage of LTR retrotransposons isolation and molecular marker development in peanut.

栽培种花生遗传基础狭窄，分子标记尚显不足，而LTR反转录转座子具有的高拷贝、高度异质性和插入位点多态性等特性使其非常适合用来开发分子标记，且它的激活可能和栽培种花生在形态、生理和农艺等性状上存在着的丰富变异有关。本项目在PCR扩增出花生LTR反转录转座子RT序列的基础上，分别使用加接头半巢式简并PCR技术、iPBS技术和加接头巢式PCR染色体步移法来分离RNaseH-LTR、PBS-LTR和LTR反转录转座子全长序列，在鉴别LTR序列的基础上，开发基于LTR序列的S-SAP、IRAP和REMAP分子标记技术，并用来揭示栽培种花生遗传多样性。项目的完成将在栽培种花生上建立新的分子标记技术，引入更多的分子标记，弥补花生在LTR反转录转座子序列的分离及其分子标记开发方面的严重不足。

花生是高产高效的经济作物和油料作物，也是重要的植物油脂来源之一。但其遗传基础狭窄，高效实用的分子标记的种类和数量明显不足，进而制约了花生的分子育种进程，而LTR反转录转座子具有的高拷贝数、高度异质性和插入位点多态性等特性使其非常适合用来开发分子标记。本项目综合利用简并PCR技术、加接头半巢式简并PCR技术、iPBS技术和加接头巢式PCR染色体步移法，开展了花生LTR反转录转座子的RT序列、RNaseH-LTR、PBS-LTR及其全长序列的分离，为系统开展花生LTR反转录转座子的分子标记开发、进化和功能研究奠定了理论基础与技术储备。项目先后分离了花生属LTR反转录转座子Ty1-copia和Ty3-gypsy的RT序列400多条、20多条PBS-LTR序列和40多条RNaseH-LTR序列，掌握了染色体步移技术和磁珠吸附技术，初步建立了栽培种花生的S-SAP、IRAP 和REMAP分子标记技术，并用来揭示栽培种花生的遗传多样性。本项目发表论文6篇（其中SCI收录2篇，国内一级学报1篇），待发表文章2篇，向第六届国际花生基因组与生物技术大会提交了3份墙报，参与花生专著《生物技术研究进展》中的一个章节的撰写工作，参与育成一个花生新品种桂花99，参加申请专利4个（申请中），培养学术骨干2名，联合培养硕士研究生1名。另外，分别建立了高效提取花生高质量DNA和RNA的方法；发明了一种可同时用于分子标记和差异基因表达研究的新技术；开展了花生AhMITE1s转座子标记的研究；提出了分子标记技术的新分类思路。本项目所取得的研究结果，将为下一步花生LTR反转录转座子分子标记的广泛开发及今后花生的遗传改良和分子育种奠定基础。