透明质酸定向诱导骨髓间充质干细胞治疗骨关节炎的实验研究

骨关节炎（OA）是以关节软骨变性、骨质增生为特征的退行性关节病。患病率、致残率高。目前缺乏有效的治疗措施。对患者生活质量和社会经济有很大影响。软骨细胞增生－凋亡失衡造成的软骨修复障碍是OA发病的核心一环和治疗的最重要靶点。骨髓间充质干细胞（MSCs）具有多细胞系转化潜能和强大增殖能力，是软骨细胞前体细胞。OA滑膜液中MSCs数要高于类风湿关节炎，OA滑膜存在MSCs归巢有关粘附因子，提示MSCs在OA软骨修复中有重要作用。体外透明质酸（HA）和自体滑膜液培养诱导马间充质干细胞获得了与TGF-β相似的分化软骨细胞结果，为在体试验奠定了基础。亦有报道MSCs治疗OA会加重骨赘形成。 .OA不同病理时期局部微环境也不同。 本研究拟HA作为定向分化诱导剂和基质载体，观察体外扩增培养MSCs在兔OA不同病理时期模型上修复作用和分化情况（软骨细胞和肥大骨化标志）。探索MSCs治疗OA的可能性和最佳时机

取得了以下成果 以拉丁方设计在Muehlema法基础上，通过改变剂量和时间间隔的不同组合，摸索出了OA不同病理分期的兔模型建模条件。其X线Kellgren&Lawrence OA分级标准与大体标本McDevitt-Muir分级和组织病理学Maier分期具有一致性。一致性检验Kappa值0.905（P＜0.01)，Pearson相关系数78.80（P＜0.01)。提示将X线作为无创的不同病理时期OA兔模型造模成功率和病情变化的监测手段。不同病理时期软骨和骨合成降解标记、细胞因子以及蛋白酶也存在差异。在病理学、影像学、生化指标等多方面能模拟了人OA的病理进展变化，在国内外尚无类似报道。每个病理时期造模成功兔24只，随机分为3治疗组：HA组、MSCs组、HA诱导MSCs组（HA+MSCs组）。治疗侧膝关节予以相应治疗，对照侧膝关节以等量生理盐水治疗，每周一次×3。治疗结束后3周后进行X线、SPECT和PET-CT核素扫描。取膝关节修复标本进行大体形态学、组织病理学、免疫组织化学和免疫荧光等检测。HA+MSCs组较HA组和MSCs组有更好的影像学和病理学改善，早期治疗较进展期和慢性期有更好疗效。微环境对MSCs分化有重要影响，尤其是血清TGFβ水平（OR值2.766）。慢性期MSCs关节腔内注射反而会加重影像学和病理学进展。实时定量荧光PCR对新生修复组织成分mRNA水平的检测显示，MSCs和HA+MSCs组II型胶原和软骨蛋白聚糖（软骨标记物）表达在各个病理时期均要高于HA组。骨桥蛋白（骨标记物）、Ⅹ型胶原和基质金属蛋白酶-13（软骨肥大化标记）在慢性期表达也显著高于HA组和早期。另一方面，HA定向诱导MSCs关节腔内治疗对微环境也有调节作用。早期应用HA定向诱导MSCs分化后关节腔内注射治疗OA有最好的软骨修复效果。