线粒体缝隙连接蛋白43对脑缺血再灌注线粒体自噬过程的作用及机制

Cerebral infarction remains a leading cause of morbidity and mortality in modern society，and the effective clinical treatment methods are relatively simple. Mitochondria are recognized as the most important organelles in cerebral ischemia reperfusion injury, and the injury of structure and function directly affect the prognosis of the disease. Mitophagy is a selective process based on autophagy. It degrade the damaged mitochondria and maintain the cellular environmental homeostasis. The connexin43 is directly involved in the process of metabolism and signal transduction in ischemic tissues,and regulates autophagy level. In previous work, we have found that the up-regulation of mitochondrial connexin43 phosphorylation can reduce ischemic injury. In this study, mitochondria are the subject. We will study the possible neuroprotective targets in cerebral ischemia/reperfusion injury. We will observe the morphology and function of mitochondria after cerebral ischemia reperfusion injury and dynamic change of mitochondrial fusion and fission, clarify the regulatory role of mitochondrial connexin43 in mitophagy, explore the mechanism of mitophagy in mitochondrial connexin43.

缺血性脑卒中是当代社会危害中老年人身体健康的主要疾病之一，且现有临床治疗手段较单一。线粒体作为脑缺血再灌注损伤中公认的重要细胞器，其结构及功能的改变直接影响了疾病的预后。线粒体自噬是在细胞自噬基础上的一种选择性自噬，在缺血再灌注性损伤中，完成损伤线粒体的降解，维持细胞内环境的稳态。缝隙连接蛋白43除了作为缝隙连接通道直接参与缺血组织中的代谢、信号转导等，同时调控自噬水平。前期工作中，我们已发现线粒体缝隙连接蛋白43磷酸化水平的上调可以保护缺血组织。本课题以线粒体为研究对象，从病理生理过程研究脑缺血再灌注损伤中可能存在的神经保护靶点。观察脑缺血再灌注损伤后线粒体的形态、功能，线粒体融合和分裂动态变化；明确线粒体缝隙连接蛋白43在线粒体自噬中的调控作用；探究线粒体缝隙连接蛋白43调控线粒体自噬的相关机制。

本研究观察脑缺血再灌注损伤后线粒体的形态、功能，线粒体融合和分裂动态变化，进而明确Cx43在线粒体自噬中的调控作用，探究 mtCx43 参与线粒体自噬过程的相关机制。Western blotting 表明在缺血条件下，星形胶质细胞中 Cx43 的含量随缺血时间逐渐降低，磷酸化 Cx43（S368）的含量同样下降； IF 证明在缺血条件下，小鼠星形胶质细胞和小鼠脑冰冻切片中的 Cx43 与 LC3b 的共定位程度增加；Atg5 敲低的小鼠星形胶质细胞中 Cx43 和磷酸化 Cx43（S368）在缺血后出现了蓄积。在OPTN和NDP52分别敲低的小鼠星形胶质细胞中，Cx43和磷酸化Cx43（S368）在缺血后出现了蓄积；IF 证明在缺血条件下，小鼠星形胶质细胞和小鼠脑冰冻切片中的 Cx43 与 OPTN 以及 NDP52 的共定位程度增加；Co-IP 证明在缺血条件下，小鼠星形胶质细胞中的 Cx43与 OPTN 以及 NDP52 的连接增加。在 PINK1 敲低的小鼠星形胶质细胞中，Cx43 和磷酸化 Cx43（S368）在缺血后出现了蓄积；在 PINK1 敲低后的小鼠星形胶质细胞中，Cx43 在缺血后与 OPTN 以及NDP52 的连接发生了解偶联。应用氨基酸点突变技术将 Cx43 的 S368，Y265 以及 Y247 位点突变后证明缺血后，Cx43 与 OPTN，NDP52 以及 PINK1 的连接降低。流式细胞术证明在缺血时，阻碍 Cx43 的自噬降解会减少神经炎症的产生（TNF下降，IL-10 上升），加速 Cx43 的降解或 Cx43 的敲低会减少星形胶质细胞的凋亡比率。在缺血再灌注损伤的病理生理过程中，Cx43蛋白表达内化，mtCx43 磷酸化蛋白表达的上调，可以一定程度的降低损伤，起到脑保护的作用；而这种保护作用是通过线粒体自噬通路PINK1/Parkin通路实现的。