GAPDH对急性心肌缺血再灌注线粒体自噬调控机制的研究

The level of autophagy decides whether cells are death or live during the acute myocardial hypoxia/referpusion. Researches suggest that, GAPDH is a key protein in mitophagy. Aberrant expression or aggregation of GAPDH leads to the lack of mitophagy and the increasing of unfunction mitochondria, and induces myocardial cell death. So, reduction of GAPDH excessive expression could benefit the preservation of myocardiocytes during acute ischemia/referpusion. This research is expected to establish cell models of acute hypoxia/re-oxygenation and mice models of acute myocardial ischemia/reperfusion which could induce autophagy.We are expected to knockdown or knockout the GAPDH expression.We plan to use real-time quantitative PCR and western blot to detect autophagy initial protein, downstream associate protein and mRNA expression. We use transmission electron microscopy, immunofluorescence to detect the mitophagy expression level and demonstrate effection of GAPDH-gene-knockdown or knockout on mitophagy of myocardiocytesduring acute ischemia/referpusion. Several staining motheds are used to detect change of the cell activity and myocardial pathology images. Finally, hemodynamics and echocardiography is necessary to evaluate mice heart function. In conclusion, we should ascertain the mechanism of lack of GAPDH expression for mitophagy of acute myocardial ischemia-reperfusion and aim for the protection of myocardial cells and for improving cardiac function.

在急性心肌缺血在灌注过程中，自噬发生的水平直接影响了心肌细胞的存亡。研究者认为，GAPDH是线粒体自噬的关键蛋白，GAPDH的异常表达或聚集导致了线粒体自噬不足，无功能线粒体增加，导致心肌细胞死亡；降低GAPDH的异常聚集，有利于急性缺血再灌注后心肌细胞保护。我们拟建立体外细胞自噬模型和动物在体自噬模型，并敲低/敲除细胞GAPDH的表达。运用western blot和实时定量PCR等方法检测自噬启动蛋白以及下游相关蛋白及其mRNA的表达。利用透射电镜，免疫荧光和荧光共聚焦检测线粒体自噬发生水平,明确敲低/敲除GAPDH表达在急性缺血再灌注对于心肌细胞线粒体自噬的影响。利用多种染色方法检测心肌病理形态以及细胞活性变化。采取血流动力学和心动超声方法评估敲低/敲除GAPDH对心功能的影响。阐明敲低/敲除GAPDH对急性心肌缺血再灌注细胞线粒体自噬调节的具体机制及可能途径，对心肌细胞的保护作用。

部分患者在接受再灌注治疗后仍然面临的心肌细胞持续死亡，心功能进一步恶化的困境，临床预后严重不良，生存率明显降低。在急性心肌缺血在灌注过程中，自噬发生的水平直接影响了心肌细胞的存亡。GAPDH是线粒体自噬的关键蛋白，GAPDH的异常表达或聚集导致了线粒体自噬不足，无功能线粒体增加，导致心肌细胞死亡；降低GAPDH的异常聚集，有利于急性缺血再灌注后心肌细胞保护。.在本研究中：我们建立体外细胞自噬模型和动物在体自噬模型，并敲低/敲除细胞GAPDH的表达。运用western blot和实时定量PCR等方法检测自噬启动蛋白以及下游相关蛋白及其mRNA的表达。利用透射电镜，免疫荧光和荧光共聚焦检测线粒体自噬发生水平,明确敲低/敲除GAPDH表达在急性缺血再灌注对于心肌细胞线粒体自噬的影响。利用多种染色方法检测心肌病理形态以及细胞活性变化。采取血流动力学和心动超声方法评估敲低/敲除GAPDH对心功能的影响。.得到了以下研究结果：（1）在体外预敲低GAPDH表达，调节急性低氧复氧细胞中GAPDH的异常表达，可以减少细胞内氧化应激损伤，提高细胞自噬活性水平，从而减轻急性低氧复氧心肌损伤，减少细胞凋亡和坏死。（2）在动物实验中，通过减少急性缺血再灌注中异常表达的GAPDH水平，降低氧化应激水平，增加抗氧化物质的含量，从而减少心肌细胞凋亡和坏死，改善急性缺血再灌注后心脏收缩与舒张功能。.在急性心肌缺血再灌注过程中，自噬的发生与GAPDH的异常修饰和结构改变密切相关，异常修饰和结构改变的GAPDH容易形成异常的聚集，使之无法经由正常的降解通路，并且进一步影响细胞对异常折叠蛋白的清除能力，加重自身聚集并影响线粒体等细胞器功能，同时异构的GAPDH阻碍自噬相关蛋白的产生，减低细胞自噬水平，不利于细胞的生存。异构的GAPDH蛋白在阻止细胞自噬水平进一步增高的同时，加重了线粒体损伤，这是急性缺血再灌注过程中一个重要损伤机制。