基于HPLC-DAD-MS策略的新颖生物碱二聚体发现及其抗厌氧菌活性研究

Anaerobic pathogens are the culprits of human oral diseases with the growing problem of antibiotic resistance. Thus, the search for new anti-anaerobic drugs had become an urgent need for patients. Curvularia sp. IFB-Z10 resided in the gut of white croaker (Argyrosomus argentatus). Curvulamine possessed novel dimeric alkaloid structure, and showed significant activity against clinical oral anaerobic bacteria with the MIC values from 0.32 to 0.77 μM. To find more anti-anaerobic agents, in this proposal, we focus on optimization of cultivation medium ingredients in order to producing alkaloid polymeric compounds using the HPLC-DAD-MS method; A specific targeted isolated method was designed for finding, identifying and separating alkaloid polymers with the help of sephadex LH-20 column chromatograph and pre-HPLC; Structures of isolated compounds and absolute configurations will be established by comprehensive modern spectroscopic techniques, single crystal X-ray diffraction methods etc. Anti-anaerobic activities of isolates will be screened, and their active mechanism will be studied. In this proposal, we look forward to finding novel structural dimmeric alkaloids with antimicrobial activities, which would provide lead compounds for new innovative drug research & development.

厌氧病原菌是引发人类口腔疾病的罪魁祸首，其耐药性不断增强，因此发现新先导化合物、研发新型抗厌氧菌药物已成为临床用药的迫切需求。Curvularia sp. IFB-Z10是来自于海洋白姑鱼肠道的共生真菌，其产生的生物碱curvulamine对临床口腔厌氧菌具有显著抑制活性。为发现更多具有抗厌氧菌活性生物碱二聚体，本项目拟基于HPLC-DAD-MS技术优化培养基配方和培养条件，诱导Curvularia sp. IFB-Z10产生结构多样的生物碱二聚体；利用凝胶柱色谱、半制备型HPLC等仪器设计一条生物碱类二聚体的特异性富集和分离方法；综合利用现代波谱技术、X-射线单晶衍射技术等方法确定新化合物的平面结构和绝对构型；对分离的生物碱二聚体进行抗厌氧菌活性筛选、构效关系分析和活性机制研究。本项目致力于发现结构新颖、抗厌氧菌活性显著的新生物碱二聚体，为创新型海洋抗厌氧菌药物的研发提供先导化合物。

目前，海洋微生物来源天然产物已成为药物先导化合物的重要来源。海洋弯孢霉Curvularia sp. IFB-Z10是一株海洋白姑鱼肠道真菌，前期研究表明在察氏培养基液态发酵下可产生新骨架结构的具有抗菌活性和抗炎活性的生物碱类二聚体和三聚体化合物。.采用了一菌多产物（One Strain-many Compounds, OSMAC）策略，简单高效地提高海洋弯孢霉IFB-Z10次生代谢产物多样性，通过筛选显著增加海洋弯孢霉IFB-Z10次生代谢产物多样性的培养条件，发现以大米为培养基的固态培养能够显著提高其次生代谢产物的多样性。利用硅胶柱层析、ODS反相柱层析、葡聚糖凝胶LH-20柱层析、大孔树脂柱层析、MCI柱层析和HPLC等多种分离技术分离获得13个单体化合物。综合运用多种现代色谱和光谱技术（HRESIMS、ESIMS、1H-NMR、13C-NMR、HSQC、HMBC、ROESY和ECD）鉴定了16个化合物的结构， 包括6个双环聚酮类化合物，其中4个为新化合物；7个新的缩酚酸环醚类化合物，其中包括1类新骨架化合物和3个已知的化合物。.通过筛选分离获得的部分化合物的活性，双环聚酮类化合物CA-2和CA-5对于肝癌细胞耐药株 BEL-7402/5-FU具有良好的抑制活性，IC50值分别为13.07和12.46 μM。化合物CA-7对牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）具有较好的抗菌活性，MIC值为65 μM。缩酚酸环醚类化合物CA-7对于肝癌细胞株BEL-7402和肝癌细胞耐药株 BEL-7402/5-FU具有良好的抑制活性，IC50值分别为9.85 μM 和 2.46 μM。.首次报道Curvularia sp. IFB-Z10生产具有肿瘤抑制活性的双环聚酮类化合物和缩酚酸环醚类化合物，分离鉴定了4个新双环聚酮类化合物和7个新缩酚酸环醚类化合物，发现的新化合物丰富了天然产物的结构类型，确证的活性分子为抗肿瘤活性新药先导化合物的发现提供了源头分子。.