快速超分辨率显微成像技术的优化及其在核孔蛋白构成与变化研究中的新应用

Photo-activated localization microscopy (PALM) was lately developed as a super-resolution imaging technique. However, the fairly long imaging time limits the continuous observation of fast development of life science. And the super-resolution imaging of a biological molecule in situ is currently limited to a resolution of ~15 nm, which is difficult to determine molecular scaffold of biological complexes. In this proposal, we are aiming to setup a new super-resolution imaging methodology by combining speed-pick-PALM (sp-PALM) with single-molecule localization (SML), which is fast, with high resolution and 3D localization. In our previous work, a resolution of 5 nm has been achieved by sp-PALM for a single molecule in living cells. Furthermore, SML with a time resolution as fast as 20-50 ms was carried out. Now we propose to improve the two techniques, and combine sp-PALM with SML for the first time to study the nuclear pore scaffold structure and dynamic. The study will address the important questions of nucleoporin stoichiometry within the nuclear pore complex (NPC), the localization of nucleoporins, and the dynamic of nucleoporins. This study may provide important scientific information for the NPC structure, the transport mechanism of NPC, and the mechanism of some NPC-related diseases. The techniques and researches will greatly improve the studies of biological supramolecular structure and dynamic development.

近年来发展起来的光激活定位显微成像技术(PALM) 尽管拥有超分辨光学显微的优点，但其成像时间长，难以对快速生命过程进行高分辨的连续观测；且目前它对活细胞中单分子的定位精度只能达到15 nm左右，难以分辨复杂结构中的单个分子。本项目提出一种速率选择PALM（sp-PALM）与单分子定位（SML）技术相结合的新型超分辨成像方法，实现快速、超高分辨率和三维定位的成像。在前期实验中，sp-PALM技术对活细胞中单分子获得了5 nm的定位精度，而SML技术可以在20-50 ms的时间分辨率下实现快速连续监测单分子。本项目将优化这两种技术，并首次将两者结合用于活细胞中核孔蛋白的研究，以掌握核孔蛋白的构成、空间位置、动态变化规律，全面了解核孔结构，为揭示核孔的运输机理、与核孔相关的疾病机理奠定基础。这些技术和结果将极大地推动生物超大分子结构及其演化行为研究的发展。

近年来发展起来的光激活定位显微成像技术(PALM) 尽管拥有超分辨光学显微的优点，但其成像时间长，难以对快速生命过程进行高分辨的连续观测。本项目搭建并优化了一种速率选择PALM（sp-PALM）与单分子定位（SML）技术相结合的新型超分辨成像方法，并实现了快速、超高分辨率和三维定位的成像，其中空间分辨率可达5-15nm，时间分辨率可以高达30-50ms。该方法被用于在活细胞中，研究单个核孔上的几十种核孔蛋白。核孔复合体是真核细胞中最大的复杂结构之一，由〜30个不同的核孔蛋白（Nups）组成。本项目成功地在活酵母菌中研究了共计24种Nups，包括8个外围Nups和16个脚手架Nups。发现每个核孔复合体平均有8~16个拷贝，该发现与先前的估计值大致相符，但个别种类的Nups有显著偏差。其中Nsp1和Nic96的数目都只有16个，而不是先前估计的32个。SML方法也被用于测量了四种Nups的动态变化情况，发现其中三种Nup60, Nup49, Nup133比较活跃，在几秒到几十秒时间内发生了结合核孔或脱离核孔的现象，平均时间为22-31 秒。而Nup157在两分钟时间内没有表现出新的结合核孔现象，是一种稳定结构的Nup。以上结果对掌握活细胞中NPC的蛋白组成和三维空间结构至关重要。同时，这种原位分子计数和动态监测技术，可以测量细胞中NPC或其他超分子结构的结构功能模型，因此该技术未来有望被推广应用于研究其它超大分子复杂结构与演化行为的生物医学问题。