锰过氧化物酶催化偶氮染料降解的产物分析及酶分子修饰改造

The degradation of the environmental pollutants by the enzymatic action provides us possibilities and methods to fulfill green technology. However, due to the complex structure of the synthetic dyes, the levels of these compounds degradation and biotoxicity of their degradation products have not yet raised enough attention. It has been discovered by our previous researches that the MnP of Irpex lacteus F17 differs significantly from the MnP of the archetypal white-rot fungus Phanerochaete chrysosporium in their molecular structure and amino-acid sequences, as well as mature protein lengths. Besides, the decolorization capability of the Irpex lacteus F17 has been proven to be remarkable. Therefore, this project, based on former work, emphasizes on the study of chemical conversion of azo dyes during the degradation process and further on the analysis of their degradation products and their biotoxicity. Meanwhile, with respect to catalytic properties and molecular structure of the MnP, desired mutation sites are chosen, and molecular engineering of the enzyme are carried out purposefully in order to improve enzymatic activity and stability by the use of chemical modification and rational mutation technology, and to acquire new usable MnP for more effective pollutants degradation and innoxious products. Consequently, this project would ,undoubtfully, deepen the study of biodegradation and provide theoretical and technical support for effective pollutant treatment.

酶促催化污染物的降解为我们提供了实现绿色工艺的途径和希望。然而，由于染料结构复杂，生物降解的程度及其生物毒性未能引起足够重视。前期研究发现乳白耙齿菌（Irpex lacteus F17）产生的胞外锰过氧化物酶（MnP）与白腐真菌模式种黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）的MnP具有明显的结构和氨基酸序列及成熟蛋白长度的差异，且该酶表现了良好的染料脱色性能。因此，本项目在前期工作基础上，注重研究偶氮染料脱色降解的化学转化过程，分析其降解产物以及产物的生物毒性。同时，根据该酶催化反应的特点和其分子结构，选择理想的突变位点，将理性突变技术与化学修饰相结合对酶分子进行有目的地改造，提高酶的催化活性和稳定性能，以获得具有应用价值的新MnP酶，达到更高效率地降解污染物、产物无害化的目的。因此，本项目无疑将会促进生物降解研究的深化，为污染物的治理提供理论和技术支撑。

乳白耙齿菌F17是实验室选育的一株产生锰过氧化物酶（MnP）的白腐真菌，且产生的MnP表现出良好的偶氮染料脱色性能。然而，由于染料结构的复杂，MnP对其脱色降解的程度及其降解产物的生物毒性未能引起足够重视。此外，如何高效地发挥MnP的催化作用，最大限度地减少毒性污染物的排放成为研究的重中之重。因此，本项目紧紧围绕染料降解产物的分离和分析、酶分子结构和功能及其催化机制展开研究。主要研究内容和结果包括：①建立和优化MnP对多种染料的脱色反应体系，获得有效的降解产物提取方法，推测出MnP催化偶氮染料酸性红18和三苯甲烷染料孔雀石绿降解的途径，评估了染料脱色降解前后的生物毒性；②克隆和表达乳白耙齿菌F17的MnP，表明其属于真菌分泌的血红素过氧化物酶Class II, group A短MnPs家族的新成员；③开展MnP的化学修饰和定点突变研究，解析出酶分子的结构和关键氨基酸残基，且实验表明该MnP的催化作用主要依赖于Mn2+的存在和氧化。然而，该MnP也表现出短MnPs家族的不依赖Mn2+的氧化特征，但其氧化活性明显低于Mn2+的存在；④分析出MnP氧化愈创木酚的中间产物及其产生主要自由基的途径，其作用机制是以C-C自由基偶合为基础的一系列低聚物反应；⑤获得多个MnP突变体，其中两个突变酶氧化2,6-二甲氧基苯酚的催化效率分别比重组酶高170倍和34倍，揭示MnP的E166残基是其不依赖Mn2+、氧化底物的关键位点；⑥开展了乳白耙齿菌F17的全基因组测序与分析，发现该菌株含有13个MnPs，均属于Class II家族的短MnPs。因此，本项目研究全面解析了乳白耙齿菌MnP在有Mn2+和无Mn2+存在下，对酚类和染料等芳香族化合物氧化的性质及其催化机制，提供了增强酚类氧化的突变酶以及新的酶结构和功能信息，研究为酶促催化环境污染物的降解提供理论和应用基础。