短链氯化石蜡对PPARα受体的激活作用及其影响细胞代谢的分子机制研究

Short-chain chlorinated paraffins (SCCPs) pose a threat to human and ecosystem health, for their similarity in physical and chemical properties to persistent organic pollutants (POPs) and high environmental levels. However, data on the adverse effects of SCCPs remain scarce. The molecular target and toxic mechanism of SCCPs are still unknown. The peroxisome proliferator activated receptors α (PPARα) is a ligand-dependent transcription factor and plays a vital role in hepatic metabolism regulation. Our previous data indicated that PPARα is a potential molecular target for SCCPs and SCCPs probably induce hepatic metabolic disorders via PPARα activation. In order to test this hypothesis, we first predict interactions of SCCPs with PPARα receptor by molecular docking and verify their ability to bind and activate PPARα receptor by a receptor competitive binding assay and a luciferase reporter gene assay. Then, metabolic responses to SCCPs, i.e. the expression of key metabolic enzyme gene, content of enzyme protein, enzyme activity, and metabolomics, of normal or PPARα-knocked-out human hepatocyte cell lines are compared to reveal PPARα mediated toxicity mechanism. Finally, the SCCPs induced PPARα activation is further confirmed in an in vivo test by using hepatic peroxisome proliferation and stimulated fatty acid oxidation as biomarkers. Overall, this research will elucidate the molecular target and mechanism of metabolic disorders of SCCPs.

短链氯化石蜡(SCCPs)具有持久性有机污染物属性，且环境存量较高，威胁着我国人群及生态系统健康。然而，SCCPs毒理学研究有限，其毒性机制尚不清楚。过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)是一种配体激活型转录因子，对肝脏代谢具有重要调控作用。本团队前期研究发现，PPARα是潜在的SCCPs毒性作用靶点，SCCPs可能通过激活PPARα从而引发细胞代谢紊乱。在此基础上，本项目首先利用分子对接模拟SCCPs分子与PPARα受体间的相互作用，并联合受体竞争结合实验、荧光素酶报告基因实验确证SCCPs对PPARα受体的激活效应；其次，比较敲除PPARα基因前后，SCCPs暴露对人肝脏细胞代谢酶基因表达水平、酶蛋白含量、酶活性及小分子代谢物的影响差异，查明PPARα介导SCCPs毒性效应的分子机制；最后，利用小鼠活体实验验证研究结果。本项目将揭示SCCPs影响细胞代谢的分子机制及直接作用靶点。

短链氯化石蜡(SCCPs)因具有环境持久性、生物毒性及蓄积性、远距离迁移能力等持久性有机污染物(POPs)特性而被《斯德哥尔摩公约》列入POPs受控名单。SCCPs在大气、水、沉积物、生物群落、食品，甚至是人类乳汁中被频繁检出。环境介质中的SCCPs能够通过直接接触及饮食摄入等方式进入人体，已成为威胁我国人群健康的重要因素之一。本课题结合组学技术(代谢组、转录组)及分子生物学、计算毒理学手段，系统研究了过氧化物酶体激活物增殖受体(PPARα)介导SCCPs肝细胞毒性的毒性效应与分子机制。本课题研究结果表明，SCCPs暴露24小时可剂量依赖地上调大鼠PPARα介导的荧光素酶报告基因的表达；同时，100 mg/kg/day SCCPs暴露28天显著升高了大鼠肝脏PPARα下游调控基因的表达(包括Pex11a、Decr2、Ech1、Ehhadh、Acaa1、Acadl、Acadvl、Hadha、Decr1、Eci1和Cyp4a1)，并显著刺激大鼠肝脏脂肪酸的氧化分解，表明SCCPs可能通过激活大鼠PPARα受体信号通路从而对肝脏脂肪酸代谢产生干扰。相反地，SCCPs对人PPARα的激活效应较弱。100 μg/L SCCPs暴露24小时能够显著下调HepG2细胞CPT2、ACSL1、ACOX1、ACADM、EHHADH及PLIN2等人PPARα下游调控基因的表达水平，并同时引起胞内脂肪酸和长链脂酰肉碱的积累，抑制细胞脂肪酸分解代谢。此外，100 μg/L SCCPs暴露还显著刺激了HepG2细胞的无氧糖酵解作用，并同时抑制三羧酸循环过程，对细胞能量代谢产生干扰作用。通过分子对接模拟，本课题发现SCCPs对PPARα具有极强的亲和力，其主要结合方式为疏水作用，其结合力与氯含量呈正比。最后，本课题通过转录组测序技术研究了SCCPs肝细胞毒性的主要分子机制。本课题从分子生物学角度揭示了PPARα受体为SCCPs的直接毒性靶点之一，能够为SCCPs的人体健康效应评估提供理论基础。