短链氯化石蜡对人肝细胞癌进展影响及机制研究

Short-chain chlorinated paraffins (SCCPs) are defined as one novel persistent organic pollutant by the Stockholm Convention in 2017. China is the major producer of SCCPs and SCCPs has been widely detected in humans. SCCPs pose fish, organ, endocrine-, and metabolism-disrupting toxicities and carcinogenicity, while the effect of SCCPs on tumor progression and its mechanism has not been well defined. The project will study on the effect of in vitro exposure to SCCPs on cell proliferation, growth, adhesion, migration, invasion, endothelium mesenchymal transition, anginogenesis, exosome excretion, exosomal miRNAs, and cellular transcriptome, in human hepacellular cancer cells. In addition, the project will investigate the effect of in vivo exposure to SCCPs on mouse growth, heptocellular and immune functions, and the growth and metastasis of human hepacellular cancer in BALB/c nude mice. Moreover, in order to find key exosomal miRNAs and cellular genes involved in the effect of SCCPs on cancer progression, the role of activation of AMPK, AKT, ERK, and NF-κB in the toxicity of SCCPs will be investigated, and the effect of key exogenous miRNA introduction and gene knock out on its toxicity will also be studied. The study will provide a more comprehensive understanding of healthy risks of SCCPs from the perspective of tumor promotion and posess theoretical and practical significance.

短链氯化石蜡新近被《斯德哥尔摩公约》定义为新型持久性有机污染物。中国是短链氯化石蜡生产的主要国家，其在人体内广泛残留。研究表明其具有鱼致死、器官、内分泌和代谢干扰毒性以及致癌性，但对其促肿瘤进展毒性的全面评价及其机制还不明确。本项目拟研究短链氯化石蜡体外暴露对人肝细胞癌细胞增殖、生长、黏附、迁移、侵袭、EMT、诱导血管生成、外泌体miRNA组和细胞转录组的影响，同时研究小鼠体内慢性暴露对小鼠生长、肝脏和免疫功能以及移植人肝细胞癌在体内生长和转移的影响。进一步，研究AMPK等调控蛋白在其促人肝细胞癌进展毒性中的作用，并在外泌体miRNA组和细胞转录组学寻找差异表达明显的外泌体miRNA和细胞中基因基础上，利用外源miRNA导入和基因敲除技术，寻找介导其促人肝细胞癌进展毒性的关键外泌体miRNA和细胞中基因。该项目有助于从促肿瘤进展毒性角度阐述短链氯化石蜡的健康危害，具有较大的理论和现实意义。

SCCPs作为最新定义的持久性有机污染物，在环境中广泛分布，并对人类产生暴露风险。而环境相关浓度的SCCPs暴露即可能对生物体产生健康风险。污染物的促肿瘤毒性对人类产生极大的健康威胁，相关研究引起了广泛重视。已有研究表明SCCPs具有致癌性，我们的前期研究也提示，SCCPs具有潜在的促肿瘤进展毒性。但对于SCCPs促肿瘤进展毒性的全面评价及其机制还未明确。. 本研究取得了如下研究内容：1.短链氯化石蜡暴露增加了尾静脉注射荷瘤小鼠肺部的转移结节数量。免疫组化结果显示，短链氯化石蜡暴露降低了荷瘤小鼠肺中E-Cadherin蛋白的表达，提高了N-cadherin、MMP-2、MMP-9和vitmentin蛋白的表达水平。与此同时，100mg/kg/d短链氯化石蜡暴露28天对Balb/c小鼠的脾脏和肺重量以及体重没有影响，但增加了肝脏重量。2.短链氯化石蜡暴露提高人肝细胞癌HuH7细胞的细胞活力。使用CCK-8试剂盒检测HuH7细胞的细胞活力。结果发现，1000μg/L短链氯化石蜡暴露提高了HuH7细胞的细胞活力。3.短链氯化石蜡促进HuH7细胞迁移能力。首先使用细胞划痕实验研究短链氯化石蜡对HuH7细胞水平迁移能力的影响。结果显示，500μg/L短链氯化石蜡处理24h，伤口面积愈合率提高了48%。Transwell迁移试验表明，20、100和500μg/L短链氯化石蜡暴露均显著促进了HuH7细胞的纵向迁移能力，迁移细胞数量分别提高了125%、319%和213%。4.短链氯化石蜡促进HuH7细胞侵袭能力。Transwell试验结果显示，20、100和500μg/L短链氯化石蜡暴露均显著促进HuH7细胞的侵袭细胞数量，与对照组相比，分别提高了183%、162%和135%。5.短链氯化石蜡调节了HuH7细胞外泌体中microRNA的表达水平。短链氯化石蜡上调了肝细胞癌外泌体中micro-425-3p和micro-150a-3p的含量。. 本项目的研究成果创新型地揭示，环境相关浓度的短链氯化石蜡具有促进肝细胞癌进展的效应，这表明，在使用短链氯化石蜡时需更加慎重的制定含量标准。