微环境变化对骨桥蛋白促进角膜新生血管形成的作用及机制研究

Corneal neovascularization is one of the reasons of blindness and one of the most prominent issues in ophthalmology in China today.To date, the pathogenesis of corneal neovascularization remains unclear. Our previous studies have shown that osteopontin(OPN) can induce rabbit corneal neovascularization and enhance the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) through the phosphorylation of AKT and extracellular signal-regulatedkinase (ERK). In turn, OPN-induced VEGF activates PI3K/AKT and the ERK1/2 pathway as a positive feedback signal.In addition, loss of OPN attenuated TGF-β1 induced expression of VEGF of ocular fibroblasts in vitro ,loss of OPN attenuated neovascularization in corneal stroma in mice,which indicates microenviroment plays an important role in CNV in vivo.Based on the results above,we intend to use recombinant adenovirus-FAP to transfect into human normal corneal fibroblasts imitating microenviroment in vitro and construct FAP+ corneal fibroblasts and vascular endothelial cells co-culture models in vitro and corneal neovascularization animal model in vivo, to observe the role and mechanism of OPN-induced corneal neovascularization by changing microenviroment of CNV.By doing this,we want to clarify the mechanism of corneal neovascularization in new insight and to provide new targets based on microenviroment for the prevention and treatment of corneal neovascularization.

角膜新生血管（CNV）是常见的致盲原因之一，也是我国眼科学目前面临的最突出的问题之一，发病机制不明。我们前期研究证实，骨桥蛋白（OPN）可诱导兔CNV形成，其机制为：OPN激活人脐静脉血管内皮细胞 （HUVECs）PI3K/Akt 和ERK1/2信号转导通路促进VEGF表达，VEGF反之可激活这一信号通路正反馈促进自身表达；另外，OPN基因敲除小鼠的眼成纤维细胞（OF），经TGF-β1刺激后，VEGF表达下降，导致灼伤诱导的小鼠CNV减少。说明体内微环境对CNV形成起到重要作用。在此基础上，靶向CNV微环境中含量最多的 FAP+OF，采用重组腺病毒Ad-FAP转染正常人角膜OF，模拟CNV微环境中的FAP+OF,行FAP+OF与 HUVECs体外共培养，结合体内动物实验，观察微环境变化对OPN促进CNV形成的影响及机制。从新的视角探讨CNV发病机制，为CNV治疗提供基于微环境组分的新靶点。

角膜新生血管是常见的致盲原因之一，也是我国眼科学目前面临的最突出的问题之一，发病机制不明。体内微环境对角膜新生血管形成起到重要作用。本课题采用角膜成纤维细胞-人脐静脉内皮细胞(umbilical vein endothelial cells ,HUVECs)共培养体外模型模拟体内微环境，观察其对角膜新生血管形成的影响。首先， 我们利用飞秒激光角膜屈光手术中的角膜基质透镜进行培养角膜成纤维细胞，获得了成功稳定快速的细胞培养体系，避免了培养过程角膜内皮细胞与上皮细胞的污染，为角膜成纤维细胞的培养找到了“得天独厚”的组织来源，即角膜基质透镜，成功建立了角膜成纤维细胞-脐静脉内皮细胞(umbilical vein endothelial cells ,HUVECs)共培养体系。研究结果表明骨桥蛋白(OPN)能够激活角膜成纤维细胞和HUVECs，并且促进HUVECs迁移。其中共培养组内皮细胞迁移更明显；采用real-time PCR 、ELISA、Western-blot等方法研究骨桥蛋白对角膜成纤维细胞与HUVECs相互作用机制，结果表明：角膜成纤维细胞与HUVECs共培养模型在OPN能够诱导下VEGF的表达，且高于HUVECs单独培养组（p<0.05），角膜成纤维细胞在VEGF表达中具有一定的作用，是潜在的抗新生血管的靶细胞。Western-blot表明，骨桥蛋白通过ERK1/2、PI3K/AKT等信号通路诱导角膜成纤维细胞与HUVECs共培养模型VEGF表达，进而促进新生血管形成，共培养组高于单独培养组（p<0.05）。 在共培养组与单独培养组，加入各种抑制剂及抗体后，VEGF表达均明显下降， 其中OPN抗体组下降最明显（p<0.05）。 骨桥蛋白是一种潜在的抗角膜新生血管的有价值的靶标,初步阐明了微环境变化对骨桥蛋白在诱导角膜新生血管形成中的作用。