Profilin2介导的神经细胞粘附分子促进神经元肌动蛋白聚合的机制研究

Actin cytoskeleton provides the driving force for neurite outgrowth,plays a pivotal role in the development and regeneration of the nervous system,however,its dynamic regulation is still poorly understood.Our latest study showed that neural cell adhesion molecule(NCAM) accelerated the actin polymerization in neurons(J Neurosci 2013).To explore the underlying molecular mechanism,we performed a yeast two-hybrid screening to search for novel binding partners of NCAM and identified profilin2,an important actin binding protein.Hence,we propose that NCAM promotes neuronal action polymerization through profilin2.To verify this hypothesis we plan to carry out co-immunoprecipitation,co-localization and ELISA to confirm the physiological direct binding between NCAM and profilin2,and to determine the binding sites.The overexpression or gene silence of NCAM and profilin2 and the generation of mutated constructs will help us to investigate the promotion of actin polymerization and neurite outgrowth accompanying the binding between NCAM and profilin2.We will also focus on the role of lipid raft in regulating the interaction between NCAM and prolilin2,thus,giving answers to how NCAM maintains the normal morphology and motility of neuronal growth cones,and how NCAM promotes neurite outgrowth.Our study aims to contribute to a better understanding of the physiological function of NCAM,shedding light on the mechanism of dynamic actin cytoskeleton modulation, providing new insights on the pathogenesis and therapeutic targets of related diseases.

肌动蛋白细胞骨架是神经突生长的动力来源,对神经系统发育和再生至关重要，然而对其动态调控的机制仍知之甚少。申请者最新研究发现神经细胞粘附分子（NCAM）促进神经元内肌动蛋白聚合（J Neurosci 2013），前期研究利用酵母双杂交发现一种重要的肌动蛋白结合蛋白――前纤维蛋白2为NCAM的结合伴侣。因而我们提出NCAM通过前纤维蛋白2促进神经元肌动蛋白聚合的假说。为验证这一假说，我们将利用免疫共沉淀、共定位、ELISA技术明确NCAM与前纤维蛋白2的生理性直接相互结合，确定结合位点。利用基因过表达、基因沉默和突变载体构建等手段确立二者相互作用可加速肌动蛋白聚合和神经突生长，并对脂筏在二者相互结合中的作用加以探讨，从而明确NCAM维持神经元生长锥形态和运动性、促进神经突生长的机制。本研究旨在深化对NCAM的生理功能和肌动蛋白细胞骨架动态调控的认识，探索相关疾病发病机制并为其治疗提供新的靶点。

脑内错综复杂的神经环路实现了哺乳动物的高级皮层功能，然而目前对皮层发育的精细调控过程仍知之甚少，神经发育异常性疾病仍无药可医。越来越多的证据表明神经细胞粘附分子（NCAM）对神经发生过程具有关键性调节作用。为探索NCAM调节神经系统发育的分子机制，我们利用酵母双杂交筛选NCAM的结合伴侣，并结合免疫共沉淀、共定位和酶联免疫吸附技术证实：一种重要的肌动蛋白结合蛋白——前纤维蛋白2与NCAM在生理条件下直接相互结合。二者的结合位点被确定为NCAM的氨基酸序列749和750，脂筏可能对二者的相互结合起调节作用。在胚胎发育过程中，NCAM与前纤维蛋白2动态共表达于大脑皮层。条件性NCAM基因敲除小鼠脑内神经干细胞的增殖和皮层各层中神经元的数量在神经发生早期均显著下降，继之以胶质细胞的产生增加。利用前纤维蛋白2过表达/RNA干扰和NCAM抗体刺激/突变载体构建等手段我们明确了NCAM通过前纤维蛋白2调控肌动蛋白细胞骨架动力学，进而促进神经干细胞增殖和向神经元方向分化、减少胶质细胞形成。在神经元的发育成熟过程中，NCAM和前纤维蛋白2的相互结合继续在维持神经元生长锥的形态和运动性、促进神经突生长中发挥作用。本研究深化了对NCAM生理功能和肌动蛋白细胞骨架动态调控的认识，探索了皮层发育和再生的分子机制，丰富了相关疾病的发病机制研究，为其治疗提供了新的靶点。