港源8号抗稻瘟病基因的精细定位及功能解析

Rice blast is a devastating fungal disease, which threats to the production of northern japonica rice. The setting percentage and rice quality of japonica rice varieties got worse when they were crossed with indica rice, so it is crucial to excavate broad spectrum resistant genes to rice blast in japonica rice genetic resources. Gangyuan8, a northern japonica rice variety, have wide-spectrum, powerful and durable resistance to rice blast. It's worth mentioning that the cultivar is resistant to false smut, sheath blight and bacterial leaf blight, too. In the previous study, the blast resistant gene of Gangyuan8 had been mapped in Chr12：10.45~11.10Mb, and pita were found in this interval. When Pita was knocked down from Gangyuan8, the resistant spectrum of transgenic plant is same to Gangyuan8, which shows that Gangyuan8 carries a new rice blast resistant gene. Based on previous studies, this research tries to carry out the followed studies in depth: The first, we want to select recombinants by SNP markers to map the gene deeply. The second, we try to forecast the candidate genes according functional annotation and sequence polymorphism. The third, we want to prove the genes' function by constructing vectors and genetic transformation. Our study is scientifically and practically important to detect rice blast resistance genes, and breed japonica rice varieties with resistance to rice blast disease.

稻瘟病对北方粳稻生产威胁严重，利用籼型抗源对粳稻进行抗性改良可造成后代结实率和米质下降，因此，从粳型材料中挖掘广谱抗稻瘟病基因至关重要。北方粳稻品种港源8号对稻瘟病抗性强、抗谱广、抗性持久，而且对稻曲病、纹枯病和白叶枯病也具有较强抗性。申请人在前期研究中，已利用RIL群体将其抗稻瘟病基因定位于Chr12：10.45-11.10Mb范围内，该区域包含一个已知基因Pita，将其从港源8号中敲除后转化子抗谱不变，表明其携带新的广谱抗稻瘟病基因。本项目将在前期研究基础上，深入解析该基因的结构和功能，包括：1.利用所开发的初定位区域SNP标记，在回交群体中筛选重组子，精细定位抗病基因；2.根据基因的功能注释及序列多态性确定候选基因；3.构建候选基因CRISPR多基因敲除载体及超表达载体并转化受体品种，验证基因的功能。本研究对于不同类型抗稻瘟病基因资源的发掘及抗病品种选育具有重要的科学意义和实用价值。

稻瘟病是对我国水稻生产具严重威胁的首要真菌病害，挖掘抗稻瘟病基因并利用其选育抗病水稻品种是该病防控的根本途径。本项目从北方粳稻中鉴定到一个对稻瘟病在多年多点表现稳定抗性的粳稻资源港源8号（GY8），通过与感病品种辽星1号构建重组自交系群体，并在病害重发区进行多年多点表型鉴定，采用水稻8K芯片鉴定亲本及群体的基因型，将GY8携带的抗稻瘟病基因精细定位于Chr12:10.45-11.10Mb的区间内。该区域包含两个已知的抗稻瘟病基因Pita和Ptr，将2个基因分别从港源8号中敲除，突变体仍对稻瘟病表现抗病，表明该品种携带不同于Pita及Ptr的新基因。通过测定定位区域内候选基因的序列，发现有5个基因在抗感亲本间具显著差异，将这些基因分别构建过表达载体和敲除载体，转化辽星1号和GY8，发现LOC_Os12G19030.1在辽星1中过表达后可显著挺高其对稻瘟病的抗性，同时，该基因从GY8中敲除后，突变体感病性增强，表明该基因是赋予港源8号对稻瘟病抗性的主效基因，将其命名为Pi67。为了进一步解析港源8号对稻瘟病具广谱抗性的机制，我们采用转录组测序及蛋白质组测序对GY8和普感品种丽江新团黑谷（LTH）接种稻瘟病菌前后的样品进行分析，发现LTH在接种稻瘟病菌后，一些与植物抗性相关的基因在转录组水平上调表达，但在蛋白水平受到抑制，而在GY8中这些抗病蛋白在转录组和蛋白质组层面均被诱导表达。这些基因主要参与植物与病原菌的相互作用、植物激素信号转导、脂肪酸代谢、过氧化物酶体生物合成等，其中所编码的61个蛋白存在相互作用关系，包括“过氧化物”、“糖苷酶”、“几丁质酶”和“PR14基因家族”互作簇。在“过氧化物”互作簇中，许多蛋白质在GY8中下调，而在LTH中上调或不变；在“糖苷酶”相互作用簇中，GY8的相关蛋白上调或不变，而LTH中9个葡聚糖酶均下调，同样，几丁质酶互作组中，接种稻瘟病菌后，GY8中PR2、Cht8、RCB4均显著上调，但LTH中相应蛋白的活性未发生变化或下调。表明GY8在受稻瘟病菌侵染后，在抗病基因的介导下，抗病相关基因协同作用，不仅对有效地控制了稻瘟病菌的繁殖及扩展，也维持了氧化还原代谢的相对平衡，使植物在抵御病原菌侵染的同时使健康细胞不受侵害。