CRISPR系统对志贺菌耐药与毒力的调控机制研究

Nowadays, Shigella is showing multidrug resistance and high virulence, which significantly threatens public health and increases the clinical treatment burden. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR), as an acquired immunity system newly found in prokaryote, can regulate the drug resistance and virulence of bacteria, but the mechanism is unclear. Here, focusing on the two most common species (Shigella flexneri and Shigella sonnei) among shigell spp., we utilize the techniques of bioinformatics and molecular biology to analyze the homology of CRISPR system among the strains with different drug resistance and/or virulence, and explore the genetic similarity between CRISPR's structure and Shigella's drug resistance and/or virulence, and then study the role of CRISPR system in the conjugal transfer among the strains with different drug resistance and/or virulence. According to the above analysis, we finally find out the regulation mechanism of Shigella's CRISPR system on the drug resistance and virulence. This is the first study on the mechanism of Shigella's CRISPR system on the coordinated regulation of drug resistance and virulence. This study will help to find out the molecular regulation mechanism that high virulent pathogen obtains antimicrobial resistance, and provide technical support for effectively preventing and controlling pathogenic bacteria with high virulence and multidrug resistance.

志贺菌近年来呈现多耐药、高毒力特点，严重危害人类健康。CRISPR(成簇的规律间隔短回文重复序列)是新发现的原核生物获得性免疫系统，具有调控细菌耐药和毒力的重要作用，但具体的作用机制不清楚。本课题以福氏和宋内两种国内主要流行志贺菌为研究对象，利用生物信息学和分子生物学等技术，分析志贺菌不同耐药程度、不同毒力强度菌株间CRISPR系统的差异，确定志贺菌CRISPR系统间区与其耐药/毒力基因的同源性关系，研究CRISPR系统与志贺菌不同耐药程度、不同毒力强度菌株间可否接合转移的关系；阐明CRISPR系统对志贺菌通过接合转移等水平基因转移获得耐药/毒力的调控作用途径，最终明确CRISPR系统对志贺菌耐药和毒力的共调解机制。本课题属首次研究CRISPR系统对志贺菌耐药和毒力的调控机制，为有效防控多耐药高致病性细菌的传播和流行提供技术支持。

志贺菌（Shigella spp.）是一类引起细菌性痢疾的重要肠道致病菌，成簇规律的短回文重复序列（CRISPR）是细菌中的一种获得性免疫系统，主要结构包括重复序列、间隔序列以及Cas蛋白基因序列。已有的研究表明CRISPR在细菌的毒力、耐药以及代谢等方面也发挥了重要的调控作用。我们对志贺菌中CRISPR系统的遗传多态性进行了研究，通过对246株不同型别志贺菌中五个CRISPR位点筛选与测序，全面掌握了志贺菌各群及亚型中的CRISPR位点的存在性及多态性，发现了志贺菌中存在的20条间隔序列，将此间隔序列与志贺菌染色体序列、质粒序列与噬菌体序列数据库进行同源性比对，结果显示共有4条间隔序列与stx2（Shiga toxin 2，志贺毒素2）溶原性噬菌体存在同源性片段，表明志贺菌CRISPR在控制stx溶原性噬菌体在菌株间的转移过程中发挥了功能，从而调控志贺菌毒力的传播。通过比对发现志贺菌CRd位点存在I-E型Cas蛋白基因序列，随后对20株志贺菌的Cas蛋白序列筛查，发现与正常的I-E型CRISPR相关蛋白序列相比，宋内志贺菌的CAS蛋白序列中存在两段插入序列IS600及ISffl2。采用无痕敲除的方法，对志贺菌中两段插入序列及其插入的两个CAS蛋白进行无痕敲除构建突变株。Biolog生化反应及耐药性分析结果显示CRISPR中的插入序列影响了志贺菌对抗生素氨曲南、二甲胺四环素的耐药性。对恢复了CRISPR完整结构的突变株的耐药质粒转化实验结果显示，在敲除了插入序列，恢复了Cas蛋白基因簇，并解除了HNS的抑制之后，耐药质粒转化的效率明显降低，说明突变株中的CRISPR系统能够正常发挥免疫功能，有效的阻止耐药质粒进入菌体。iTRAQ差异蛋白组学分析结果显示与志贺菌耐药相关的strA、gyrA、gyrB等蛋白，以及与志贺菌毒力相关的细菌 I 型分泌系统相关的glnH、potD、yehZ、yrbD、yjgQ蛋白，II 型分泌系统（T2SS）相关的SecA、SecB和FtsY等蛋白均发生了不同程度的下调，说明志贺菌CRISPR系统是通过影响这些蛋白来对其毒力和耐药性进行共调控作用。本研究还发现志贺菌CRISPR对其代谢与耐酸性也存在调控作用，并基于志贺菌各型别中CRISPR系统的多态性建立了CRISPR位点的分子分型新方法。