利用噬菌体和纳米材料载体递呈CRISPR/Cas9系统靶向清除细菌耐药性研究

Bacterial antibiotic-resistance seriously defected efficacy of antibiotics. Recently, researchers highly focused on phage therapy and developed CRISPR/Cas-integrated phage to kill bacteria through lethal genome targeting. However, many problems remained in previous work, such as development of new resistance, insufficient bactericidal efficacy and being incapable of preventing the transfer of resistance plasmid. Our study invent an one-step method for phage genome recombination with the CRISPR/Cas9 and delivery the CRISPR/Cas9 system to target bacterial resistance plasmids, thus to restore sensitivity of common antibiotics and block the horizontal transfer of bacterial antibiotic resistance genes. We will also develop nano-materials-based vectors to deliver the CRISPR/Cas9 system within broader range of bacteria strain and species. Delivery efficiency of the CRISPR/Cas9, clearance rate of resistance plasmid and combined treatment effect with resensitized antibiotic will be comprehensively illustrated. Through proposing the strategy of removing bacterial resistance using CRISPR/Cas9 and verifying combined therapeutic efficacy against resistant bacteria in vitro and in vivo, this research will lay the theoretical and technical foundation for treatment and prevention of drug-resistant pathogens.

细菌耐药严重影响了抗生素对细菌感染治疗的效果。近年来，噬菌体抗菌技术备受关注，同时发展了噬菌体递呈CRISPR/Cas9系统靶向细菌基因组以杀死细菌，但上述技术还存在诸多问题，例如容易产生抗性且杀菌效力尚显不足、无法抑制耐药质粒转移等。本研究将新建一步法噬菌体重组CRISPR/Cas9系统技术，递呈CRISPR/Cas9系统靶向清除细菌耐药质粒以恢复抗生素敏感性，并联合使用致敏抗生素有效治疗耐药菌感染并阻断耐药质粒转移；同时建立纳米载体递呈CRISPR/Cas9系统技术，实现跨菌种清除细菌耐药性；还将系统阐明CRISPR/Cas9不同递呈系统效率、耐药性清除机制、联合抗生素治疗耐药菌感染效果等关键问题。本研究提出CRISPR/Cas9系统清除耐药性并联合致敏抗生素治疗耐药菌感染的策略，并通过体内外实验验证该方法的疗效，为防治细菌耐药提供理论和技术上的支撑。

针对目前细菌耐药性检出率不断上升，一线抗生素耐药率逐年升高，“超级细菌”频繁出现，造成的抗生素无药可用的问题，本研究研发了基于CRISPR/Cas9基因编辑系统的新型抗耐药菌技术。本研究筛选得到了高效清除细菌NDM-1耐药基因的CRISPR-Cas9系统，证明原核CRISPR-Cas9质粒转化耐药菌可以高效清除大肠杆菌中携带的NDM-1质粒，清除率可达99%，进而有效清除细菌携带的亚胺培南类及β-内酰胺类抗生素耐药性。创新研发了“一步法”噬菌体重组CRISPR系统技术，筛选验证了纳米三氧化二铝材料作为递呈载体的效果，实现了载体对CRISPR系统的有效包装和递呈。利用载体介导的CRISPR-Cas9系统高效靶向清除了细菌耐药质粒，在8小时内能实现大于99%的耐药质粒清除率。消除细菌耐药性的同时阻断了细菌耐药性在细菌间的传播，减少细菌耐药质粒在环境中的释放和积累，在8小时内减少了98.7%的耐药质粒释放，阻断了98%的NDM-1耐药质粒在细菌间的接合转移，抑制细菌耐药性的传播扩散。本研究在形成生物膜的耐药菌中利用载体递呈的CRISPR-Cas9系统清除50%的耐药质粒，减少50%的清除生物膜抗生素用量。体内实验中，噬菌体递呈CRISPR系统能够在小鼠皮肤感染模型和小鼠肠道感染模型中发挥清除细菌耐药质粒的作用，联合抗生素实现耐药大肠杆菌计数100000-1000000倍的降低。更重要的是，与烈性噬菌体等直接杀菌策略比较，本方法通过温和噬菌体递呈CRISPR系统辅助杀菌，不会导致噬菌体耐受等新耐受突变的快速出现，能够在14天内保持耐药性抑制效果。本研究能使收到细菌耐药性影响的抗生素得到重新利用，并能控制细菌耐药性的传播，有望形成一种高效杀灭耐药菌和防控细菌耐药性的新方法，在耐药性细菌防治领域有巨大的应用潜力。